NaCl浓度和pH值变化对阴沟肠杆菌腐胺代谢的影响及作用机制研究

摘要

生物胺是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化合物的总称。人体摄入过多的生物胺会产生不良的生理反应，严重会威胁生命。腐胺是食物中最常见的生物胺之一，它不仅能造成食品的腐败味，而且能增强其它生物胺的毒理学反应，也是致癌物亚硝胺形成的前体。研究报道食品中生物胺的产生主要由污染的腐败菌代谢而来，并且其代谢途径也受环境因素的影响。因此阐明环境条件如何影响食品中腐败菌的生物胺产生能力，降低生物胺的累积量具有重要的意义。前期研究发现阴沟肠杆菌是鸡肉中的优势腐败菌，并且代谢产生大量的腐胺。本研究以阴沟肠杆菌C4为研究对象，在解析该菌的腐胺代谢途径的基础上，研究食品加工中两个主要的环境因子（pH、NaCl浓度）的变化对该菌腐胺产生的影响及作用机制。
　　本研究主要内容包括：⑴采用在营养肉汤培养基中分别加入0.5％精氨酸和0.5％鸟氨酸这两种不同的底物，将活化好的菌液按1％接种量接种于不同的培养基中，置于37℃摇床培养，在不同时间段测定菌液的OD值、pH值和腐胺积累量。研究发现，加入鸟氨酸的菌液中腐胺积累量要远高于加入精氨酸菌液的积累量。因此，阴沟肠杆菌中腐胺的产生主要通过鸟氨酸的代谢过程完成，而由精氨酸产生的腐胺含量极少。⑵配制含有0.5％鸟氨酸的营养肉汤培养，将pH分别调为9、8、5、4并灭菌。将活化好的菌种按1％接种量接种于不同的培养基中，置于37℃摇床培养，在不同时间段测定菌液的OD值、pH值、鸟氨酸含量及腐胺积累量。研究发现随着pH值的降低阴沟肠杆菌的生长曲线几乎一致，但是最终上清液中鸟氨酸的含量逐渐降低，腐胺积累量逐渐升高。然后分析了不同初始pH处理下阴沟肠杆菌在对数期时与腐胺产生相关的三个基因（鲱精胺酶基因（agm）、精氨酸脱羧酶基因(arg)和鸟氨酸脱羧酶基因（orn））的表达量变化，发现agm和arg基因的表达量随着pH的改变没有显著变化，而orn基因的表达量随pH的升高显著降低。这说明阴沟肠杆菌在酸性条件下代谢鸟氨酸产生大量的腐胺，并且与鸟氨酸脱羧酶基因表达量的增加有关。⑶配制0.5％鸟氨酸的培养基(pH4)，然后加入0％、2％、4％、6％、8％的NaCl并灭菌。将活化好的菌种按1％接种量接种于不同的营养肉汤培养基中，置于37℃摇床培养数小时，在不同时间段测定菌液的OD值、pH值、鸟氨酸含量及腐胺积累量。研究发现，随着NaCl浓度的升高，阴沟肠杆菌的生长和腐胺的产量会受到不同程度的抑制，其中4％NaCl浓度会抑制该菌前期生长但是后期生长正常，但是在该条件下腐胺积累量一直没有增加。利用实时荧光定量PCR技术分析了不同NaCl条件下该菌在对数期时鲱精胺酶基因（agm），精氨酸脱羧酶基因（arg）和鸟氨酸脱羧酶基因（orn）的表达量变化，发现NaCl浓度的升高会显著抑制orn基因的表达量。综上，高盐浓度会抑制阴沟肠杆菌的生长和腐胺的产生，但是低盐浓度下阴沟肠杆菌虽然继续生长，但腐胺积累量却大幅下降，主要是由于鸟氨酸脱羧酶基因的表达量受到抑制造成的。⑷体外重组表达了阴沟肠杆菌鸟氨酸脱羧酶并分析了该酶活受环境因子变化的影响，对鸟氨酸脱羧酶的米氏常数(Km)、最大反应速率(Vm)、最适pH、最适温度等进行了研究，同时也研究了NaCl浓度对酶活性的影响。研究发现鸟氨酸脱羧酶的Km为1.666 mM，Vmax为6.398 U/mg。最适温度为30℃，最适pH为6.0。NaCl浓度为1.5％时鸟氨酸脱羧酶活性要略高于其它组。综上，阴沟肠杆菌在低pH胁迫条件下，腐胺积累量高而酶的活性很弱，说明腐胺的产生主要是由于菌株内鸟氨酸脱羧酶基因的大量表达引起的。腐胺的产生还会随NaCl浓度的升高而受到抑制，原因是NaCl浓度升高除了抑制菌株的生长外，还会抑制鸟氨酸脱羧酶基因的表达，与酶的活性并没有显著关系。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 生物胺与食品安全

1．1．1 常见生物胺及其对人体的危害

1．1．2 腐胺的产生机理

1．1．3 腐胺合成途径

1．1．4 产生生物胺的微生物种类

1．2 影响食品中腐胺产生的因素

1．3 腐胺检测方法的研究进展

1．3．1 分析方法

1．3．2 分子生物学方法

1．4 研究内容和目的意义

1．4．1 研究主要内容

1．4．2 研究目的意义

2 材料与仪器

2．1 材料与试剂

2．2 仪器

3 试验方法

3．2．2 不同氨基酸底物条件下阴沟肠杆菌腐胺积累量的测定

3．2．3 阴沟肠杆菌基因组DNA提取方法

3．2．4 目的基因PCR扩增、纯化及回收

3．2．5 目的片段与T载体连接

3．2．6 重组质粒转化E．coli DH5α感受态菌

3．2．7 质粒提取方法

3．2．8 测序

3．3 不同pH胁迫对阴沟肠杆菌腐胺积累量的影响

3．3．1 不同pH胁迫下阴沟肠杆菌菌液的OD值测定

3．3．4 不同pH胁迫下对阴沟肠杆菌基因表达量的影响

3．4 NaCl胁迫对阴沟肠杆菌的影响

3．4．1 不同浓度NaCl胁迫下阴沟肠杆菌菌液的OD值测定

3．4．2 不同浓度NaCl胁迫下阴沟肠杆菌菌液的pH测定

3．4．3 不同浓度NaCl胁迫下阴沟肠杆菌腐胺积累量的测定

3．5．1 鸟氨酸脱羧酶基因的PCR扩增

3．5．2 鸟氨酸脱羧酶表达载体的构建

3．5．3 鸟氨酸脱羧酶基因的诱导表达

3．5．4 表达产物的活性鉴定

3．5．5 乌氨酸脱羧酶最适温度的研究

3．5．6 鸟氨酸脱羧酶最适pH的研究

3．5．7 NaCl对酶活力的影响

3．5．8 鸟氨酸脱羧酶动力学研究

4 结果与分析

4．1 不同底物条件下对阴沟肠杆菌影响试验结果分析

4．1．1 不同底物条件下阴沟肠杆菌OD值变化

4．1．2 不同底物条件下阴沟肠杆菌pH变化

4．1．3 不同底物条件下阴沟肠杆菌腐胺积累量变化

4．1．4 PCR扩增及测序

4．2 不同pH梯度处理对阴沟肠杆菌影响试验结果分析

4．2．1 不同pH梯度处理下阴沟肠杆菌OD值变化规律

4．2．2 不同pH梯度处理下阴沟肠杆菌的pH变化规律

4．2．3 不同pH梯度处理下阴沟肠杆菌菌液鸟氨酸含量变化规律

4．2．4 不同pH梯度处理下阴沟肠杆菌积累腐胺变化规律

4．2．5 不同pH胁迫对阴沟肠杆菌基因表达影响分析

4．3 NaCl胁迫处理对阴沟肠杆菌影响试验结果分析

4．3．1 不同浓度NaCl处理下阴沟肠杆菌OD值变化

4．3．2 不同浓度NaCl处理下阴沟肠杆菌pH值变化

4．3．3 不同浓度NaCl处理下阴沟肠杆菌菌液鸟氨酸含量变化规律

4．3．4 不同浓度NaCl处理下阴沟肠杆菌积累腐胺含量变化规律

4．3．5 NaCl胁迫对阴沟肠杆菌基因表达影响分析

4．4 外源表达鸟氨酸脱羧酶的酶学性质及动力学研究

4．4．3 pCold1-orn在大肠杆菌中的诱导表达

4．4．4 对ODC的氨基酸序列分析

4．4．5 温度对外源表达鸟氨酸脱羧酶活性的影响

4．4．6 pH对外源表达鸟氨酸脱羧酶活性的影响

4．4．7 外源表达鸟氨酸脱羧酶动力学常数的测定结果

4．4．8 NaCl浓度对外源表达酪氨酸脱羧酶活性的影响

5 讨论

5．1 环境条件对生物胺产生的影响

5．2 胁迫环境对生物胺产生相关基因表达的影响

5．3 存在不足

5．4 展望

6 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文