米曲霉生产乳糖酶的研究

摘要

对米曲霉菌株LAO-0703生产乳糖酶进行相关的研究，包括种子培养时间和种子培养基的优化、液态发酵培养基的优化、液态发酵条件的优化、固态发酵和基本酶学性质的分析。
　　麸皮粉含有丰富的营养物质，可有效的促进菌体的生长。通过对种子培养相关营养素的单因素试验和正交试验，确定了种子培养的最佳培养时间为11h，最佳种子培养基组分为:麸皮粉2.00％，葡萄糖2.50％，酵母粉2.00％，KH2PO40.75％。在此条件下菌体湿重可达到14.61g。
　　米曲霉乳糖酶是诱导酶，在诱导因子的作用下可有效的提高酶活力，通过对米曲霉乳糖酶的研究，发现麸皮粉和桔皮粉对乳糖酶有很好的诱导作用，可显著提高酶活力。
　　米曲霉生产的乳糖酶是胞外酶，无需破壁就能进行酶的分离提取，这种乳糖酶既可以采用固态培养也可以采用液态深层培养来生产。在培养过程中酶分泌到培养基中，发酵成本低，分离提取较为方便。通过对液态发酵产酶相关的单因素及正交试验，确定出液态发酵培养基的最佳组分为:乳糖1.1％，蛋白胨0.5％，KH2PO42.0％，麸皮粉1.5％，桔皮粉1.0％。最佳发酵条件为:接种量10％，培养温度30℃，初始pH5.5，装液量50ml/250ml，摇床转数180r/min，培养时间4d。在此条件下的液态发酵产酶，可使乳糖酶的酶活力高达2348U/L，比出发菌株的酶活力提高了15.6倍。
　　在对液态发酵过程中也对固态发酵做了简单的改进，在固态发酵培养基中添加了适量的营养物质使酶活力达到8.18U/g，提高了9％。用固态发酵法产酶，虽然设备要求比较简单，易于推广，而且不易破坏酶的结构，但其缺点是容易污染杂菌;而液态发酵法相对来比较容易控制，可减少杂菌的污染，而且生产效率高，所以目前乳糖酶的生产主要还是采用液态发酵培养法。
　　为能更好的利用和保存该乳糖酶，故对此酶的基本酶学性质进行了相关的研究。结果表明:该乳糖酶的最适反应温度为55℃，表明此酶为高温乳糖酶，在此温度下可有效防止杂菌的污染;虽然在50℃下放置2h残留的酶活力还能达到90％以上，但在12h时残留酶活力就只剩一半左右，故此乳糖酶的热稳定性还不是很理想;酶液在4℃条件下保存一个月才出现较为明显的酶活力下降趋势，表明其有较好的低温稳定性;该酶的最适反应pH是5.0，pH的稳定范围在4.0～8.0，表明酶蛋白具有良好的pH稳定性;在酶反应体系中添加Mn2+可显著提高酶活力，提高率达到12.1％，而添加Cu2+和半乳糖会对酶的活性起到明显的抑制作用，酶活力下降率分别为41.8％和44.5％。

目录

摘要

1 绪论

1．1 我国乳品工业发展现状

1．2 乳糖不耐症

1．3 乳糖酶的微生物来源

1．4 乳糖酶的性质

1．4．1 不同微生物来源的乳糖酶的性质

1．4．2 乳糖酶的水解作用机制

1．5 乳糖酶的应用

1．5．1 乳糖酶在食品工业中的应用

1．5．2 乳糖酶在分析方面的应用

1．5．3 乳糖酶在酶免疫分析中的应用

1．5．4 乳糖酶在医药工业中的应用

1．6 高温乳糖酶的研究

1．6．1 高温乳糖酶的优点

1．6．2 高温乳糖酶的来源

1．7 米曲霉菌株的研究进展

1．7．1 米曲霉的生物学特征

1．7．2 米曲霉在工业上的应用

1．8 研究的主要目的及内容

2 种子培养基的优化

2．1 试验材料及设备

2．1．1 菌种及其来源

2．1．2 试验设备

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要培养基

2．2 试验方法

2．2．1 菌种的活化与继代培养

2．2．2 单孢子悬浮液的制备

2．2．3 种子培养

2．2．4 菌体湿重的测定

2．2．5 碳源的筛选

2．2．6 氮源的筛选

2．2．7 无机盐的筛选

2．2．8 麸皮粉添加量的确定

2．2．9 种子培养时间的确定

2．2．10 正交试验

2．3 结果与分析

2．3．1 米曲霉的生长

2．3．2 不同碳源对菌体量的影响

2．3．3 葡萄糖添加量的确定

2．3．4 不同氮源对菌体量的影响

2．3．5 酵母粉添加量的确定

2．3．6 不同无机盐对菌体量的影响

2．3．7 KH2PO4添加量的确定

2．3．8 麸皮粉添加量的确定

2．3．9 种子培养时间的确定

2．3．10 种子培养基的优化

2．4 本章小结

3 产酶发酵培养的优化

3．1 试验材料及设备

3．1．1 菌种

3．1．2 试验设备

3．1．3 主要试剂

3．2 试验方法

3．2．1 ONP标准曲线

3．2．2 酶活力测定方法

3．2．3 液态发酵培养

3．2．4 乳糖酶液的制备

3．2．5 麸皮粉和麸皮水的制备

3．2．6 液态发酵培养基的优化

3．2．7 液态发酵培养条件的优化

3．2．8 固态发酵

3．3 结果与分析

3．3．1 发酵液状态

3．3．2 液态发酵培养基的优化

3．3．3 培养条件的优化

3．3．4 固态发酵

3．4 小结

4 乳糖酶基本酶学性质的研究

4．1 试验材料与设备

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验设备

4．1．3 主要试剂

4．2 试验方法

4．2．1 温度对酶活性的影响

4．2．2 酶的热稳定性

4．2．3 酶的低温保存稳定性

4．2．4 pH对酶活性的影响

4．2．5 酶的pH耐受性

4．2．6 金属离子对酶活性的影响

4．2．7 抑制剂对酶活性的影响

4．3 结果与分析

4．3．1 温度对酶活性的影响

4．3．2 酶的热稳定性

4．3．3 酶的低温保存稳定性

4．3．4 pH对酶活力的影响

4．3．5 酶的pH耐受性

4．3．6 金属离子对酶活性的影响

4．3．7 抑制剂对酶活性的影响

4．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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