新月弯孢霉漆酶高产菌株选育及漆酶纯化研究

摘要

为提高新月弯孢霉分泌漆酶的产量和活性,本文利用物理诱变法(紫外-60Co-γ复合诱变,微波诱变)和化学诱变法(硫酸二乙酯诱变)对新月弯孢霉菌株进行诱变。在紫外-60Co-γ的作用下,新月弯孢霉分泌漆酶的活性由原始的0.55U/ml提高到1.668U/ml。存微波作用下,新月弯孢霉分泌漆酶活性由1.668 U/ml提高到1.914 U/ml。在硫酸二乙酯作用下,新月弯孢霉分泌漆酶活性由1.914 U/ml提高到1.949 U/ml。最终酶活比原始酶活提高了近3.544倍。新月弯孢霉菌株致死率和正突变率变化有一定相关性,致死率在80％到90％时,正突变率最高。
　　 通过以上诱变,得到高产漆酶菌株VC-W-L3,在此基础上进一步研究了新月弯孢霉VC-W-L3产漆酶的发酵条件,培养基成分。通过单因素实验、正交实验得到新月弯孢霉产漆酶的最适工艺条件为:发酵温度30℃,发酵时间72 h,培养基pH6,250 ml三角瓶装液量120 ml,摇床转速160 r/min。最佳培养基配比为:土豆200 g/L,蔗糖30g/L,大豆蛋白胨5 g/L,KH2PO45 g/L,愈创木酚0.2 mmol/L,吐温800.1 ml/L,Mg2+0.5 mmol/L,Cu2+1 mmol/L,Ca2+1 mmol/L,Mn2+0.25 mmol/L。其最高酶产量为2.306U/ml,比培养基优化前的提高了18.32％。利用工业废料作为培养基主要成分,通过单因素,正交试验得出最佳配比:废糖蜜30 ml/L,豆粕15 g/L,KH2PO45g/L,愈创木酚0.2 mmol/L,吐温800.1 ml/L,Mg2+0.5 mmol/L,Cu2+1 mmol/L,Ca2+1 mmol/L,Mn2+0.25mmol/L。最佳产酶量为1.485U/ml。
　　 通过对新月弯孢霉发酵液采用硫酸铵盐析,透析,PEG6000浓缩,DEAE-SepharoseFF离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤等纯化技术进行处理,纯化得到新月弯孢霉胞外的漆酶,最终纯化倍数为3.73,总活力回收率为31.69％,由SDS-PAGE电泳图片计算得出纯酶的分子量为86.3 kDa。
　　 以ABTS作为底物时新月弯孢霉纯化后的漆酶的最适反应pH为3.0,在pH2.8～3.5之间,漆酶活性较高;在pH为5.5～6.5的范围内稳定性最好,1h内平均剩余酶活在87％以上。新月弯孢霉纯化后的漆酶的最适反温度为30℃,在20～30℃之间,漆酶热稳定较好。纯化后的漆酶催化ABTS的米氏常数为0.064_mmol/L。染料脱色结果表明:纯化漆酶在24 h内对孔雀绿的脱色效果最好,其次为茜红素,中性红,刚果红,亚甲基蓝,最后为甲基橙。在最初12 h对孔雀绿的脱色效果最快。新月弯孢霉漆酶对混合染料有较好的脱色效果,表明该菌在染料废水处理上具有较好的应用前景。
　　 新月弯孢霉液体培养时产生的菌丝球对多种染料的脱色能力,多种染料在24h内的脱色率均达到80％以上,且菌丝球稳定性良好,可重复使用6次。