新月弯孢霉漆酶的产生、分离纯化及对染料脱色的研究

摘要

本研究从染弯孢菌叶斑病的玉米叶片中分离出一株真菌，经丁香醛连氮法、愈创木酚法和ABTS法联合检测显示该菌株是一株高产漆酶的菌株。经菌落形态，孢子形态等形态特征并结合ITS1-5.8S-ITS2 rDNA区域的序列鉴定确认该菌为新月弯孢霉，菌株编号为jqh-100。新月弯孢霉是半知菌类、多孢亚科、弯孢属的一种真菌，是引起玉米、水稻等禾本科植物病害的重要病原菌之一，也是生产氢化可的松前体物的重要菌种之一，但是关于其产漆酶的研究国内外刊物未见报道。本文在参考其它真菌漆酶研究的基础上，进一步研究了新月弯孢霉产漆酶的发酵条件，新月弯孢霉胞外漆酶的纯化及其酶学性质，以及新月弯孢霉在染料脱色中的应用。
　　通过单因素实验、正交实验及Plackett-burman实验对产酶条件进行了优化，得到新月弯孢霉产漆酶的最适工艺条件为:培养基初始pH6.0，培养温度35℃，种龄60h，摇床转速150 rpm/min，250 mL三角瓶中装入150 mL培养基。培养基成份为:黄豆芽200 g/L煮汁，蔗糖20 g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨3 g/L，硝酸铵1.2 g/L，外加0.05mmol/L CuSO4、MnSO4和MgSO4，吐温800.2 mL/L，并加0.1 mmol/L愈创木酚作为诱导剂;优化后最大酶活力可达2.8 U/mL，约是优化前的5倍。酶活高峰出现在发酵培养的第72h。
　　通过硫酸铵盐析，DEAE-Sepharose FF离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤等一系列纯化技术，对新月弯孢霉胞外漆酶进行了纯化，最终纯化倍数为2.14，总活力回收率为22.76％，由SDS-PAGE电泳图计算得出纯酶的分子量为83.8 kDa。
　　以ABTS作为底物时新月弯孢霉纯化后的漆酶的最适反应pH为2.8，米氏常数为0.069 mmol/L，在pH2.6～3.8维持较高的酶活，超过pH4.0漆酶活性急剧下降;纯酶最适反应温度为30℃。纯酶在30℃时在pH4.0～6.4的缓冲液中保温1h较稳定;在最适pH2.8下纯酶在40℃以下较稳定，超过40℃酶活迅速下降，当温度升高到60℃时，纯酶在1h内完全失去活性。以丁香醛连氮为底物时，纯酶的最适反应pH为5.0，米氏常数为0.149 mmol/L。通过12种金属离子对漆酶活力的影响研究显示: Fe2+、Fe3+对酶活有强烈的抑制作用， Cu2+在5 mmol/L对酶活有明显的促进作用。
　　染料菌体共培养体系和纯酶对染料都有较好的脱色效果，共培养体系通过菌体吸附及漆酶降解作用对茜素红的脱色率达到了90％;纯漆酶在有Cu2+存在的条件下，对茜素红的脱色效果明显更好（达到了87.7％）。又因新月弯孢霉生长产酶同其它真菌相比要快很多，且酶活性相当，因此其在工业应用中更具潜力。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．1．1 新月弯孢霉

1．1．2 漆酶

1．2 漆酶的结构和性质

1．3 漆酶的应用

1．3．1 漆酶在环境保护中的应用

1．3．2 漆酶在造纸工业中的应用

1．3．3 漆酶在食品工业中的应用

1．3．4 漆酶在生物监测中的应用

1．3．5 漆酶的其他用途

1．4 漆酶发酵条件的优化

1．5 国内外漆酶蛋白纯化及酶学性质的研究

1．6 研究目的和意义

2 漆酶高产菌株的分离与鉴定

2．1 材料

2．1．1 分离材料

2．1．2 药品

2．1．3 仪器

2．1．4 培养基

2．2 方法

2．2．1 植物内生真菌的分离

2．2．2 漆酶活性检测方法

2．2．3 菌株的鉴定

2．2．4 粗酶液制备与酶活测定

2．3 结果与分析

2．3．1 产漆酶菌株的筛选

2．3．2 菌种鉴定

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 新月弯孢霉jqh-100产漆酶培养条件的优化

3．1 材料

3．1．1 菌种

3．1．2 药品

3．1．3 仪器

3．1．4 培养基

3．2 方法

3．2．1 种子液制备

3．2．2 漆酶制备

3．2．3 酶活测定方法

3．2．4 菌丝干重

3．3 结果与分析

3．3．1 新月弯孢霉的生长曲线和产酶曲线

3．3．2 发酵条件对新月弯孢霉分泌胞外漆酶的影响

3．3．3 优化前和优化后新月弯孢霉产酶历程比较

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 新月弯孢霉jqh-100漆酶的纯化

4．1 材料

4．1．1 菌种

4．1．2 药品

4．1．3 仪器

4．1．4 培养基

4．2 方法

4．2．1 培养方法

4．2．2 粗酶液的制备

4．2．3 漆酶活性及蛋白质含量的测定方法

4．2．4 纯化步骤

4．2．5 凝胶电泳

4．2．6 温度及pH对漆酶活性和稳定性的影响

4．2．7 金属离子对纯化的漆酶活性的影响

4．2．8 纯化漆酶的动力学参数测定

4．2．9 染料的脱色实验

4．3 结果与分析

4．3．1 离子交换层析上样缓冲体系pH的选择

4．3．2 漆酶纯化结果

4．3．3 pH对漆酶活性和稳定性的影响

4．3．4 温度对漆酶活性和稳定性的影响

4．3．5 金属离子对纯化的漆酶活性的影响

4．3．6 动力学参数的测定结果与分析

4．3．7 染料脱色实验结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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