山葡萄转色期果皮cDNA文库的构建与分析

摘要

葡萄是世界范围内重要的果树树种,也是栽培品种最多的物种之一。葡萄鲜果除鲜食外,又可作为酿酒、制干、制汁等原料而具有极高的经济价值。山葡萄是我国重要的野生果树资源,具有极强的抗寒性,是我国东北地区酿造葡萄酒的主要原料。转色期作为非跃变型果实特有的一个生长阶段,是浆果在大小、硬度、色泽以及内部生理生化发生剧烈变化的时期。为了获得大量山葡萄功能基因信息,并以此为基础筛选感兴趣的目的基因,本文构建了山葡萄转色期果皮的cDNA文库,并进行了较高通量的EST测序和生物信息学分析。主要的研究成果如下:
　　 1、采用改良的CTAB法提取山葡萄转色期(50％着色)果皮的总RNA,通过LD-PCR反转录合成双链cDNA,以pDNR-LIB为载体,采用电穿孔法将重组质粒转化到DH5α中,构建了山葡萄转色期果皮cDNA文库。文库插入片段大小为0.5 kb～2 kb之间,平均约为0.8 kb。原始文库滴度为1.12×106 pfu·mL-1,扩增后的文库滴度为2.82×109pfu·mL-1,重组率接近100％,表明所构建的cDNA文库质量高,完整性好。
　　 2、从山葡萄转色期果皮cDNA文库中随机挑取1009个单克隆进行测序,去除载体以及低质量序列后,共获得974条高质量序列,占全部测序量的96.53％。将其进行GenBank提交,获得登录号为GW666520～GW667493。利用phrap软件进行拼接,共获得710个unigenes,其中包括126个contigs和584个singlets,非冗余序列占全部序列的72.90％。一致序列的有效长度分布在102 bp～1024.bp,平均长度为431.35 bp。
　　 3、将获得的710条unigenes进行功能注释,结果表明,有528个unigenes(代表722条EST)与数据库中的已知基因具有高同源性。结合拟南芥功能基因分类标准,把通过BlastX比对获得的功能描述基因(包括功能确定及推测功能的)分为10类,即能量代谢相关基因(Energy/Metabolism)占17.46％、蛋白质合成相关基因(Proteinsynthesis)占7.46％、运输体/细胞内运输相关基因(Transporters/Intracellular traffic)占5.07％、抗病防御相关基因(Disease/Defence)占6.62％、细胞结构相关基因(Cellstructure)占1.83％、信号转导相关基因(Signal transduction)占3.24％、蛋白定向与储藏蛋白相关基因(Protein destination and storage)占2.82％、细胞生长相关基因(Cellgrowth and division)占1.27％、转录相关基因(Transcription)占1.83％,以及功能不明确基因(Unclassifled)占26.76％。
　　 4、从构建的山葡萄转色期果皮cDNA文库中选取与花色苷生物合成相关的调节基因进行全长的克隆和生物信息学分析。结果显示,转录因子MYBA3基因的cDNA全长序列为764 bp,编码250个氨基酸。与其它物种相关基因的氨基酸序列进行了多重比较,其中与欧亚种葡萄(Vitis vinifira L.)相关基因的序列相似性达到了97％。对该基因编码蛋白质的信号肽结构、疏水性等性质进行了预测,并初步预测了其二级结构。