我国东北地区野生鸟类感染鸡贫血病毒的分子流行病学研究

摘要

鸡贫血病毒(Chicken Anemia Virus，CAV)是鸡传染性贫血(CIA)的病原，主要感染雏鸡，引起以鸡群死亡率升高，再生障碍性贫血，骨髓黄化，胸腺等淋巴器官萎缩为特征的免疫抑制性传染病。以往CAV的流行病学报道大多是集中在家禽，而有关野生鸟类感染的数据极少。1998年，有日本学者发现CAV可以感染鹌鹑、鸽子和乌鸦，说明鸡并不是CAV的唯一宿主。野生鸟类生存环境范围比较大，而且每年都会发生迁徙，如果野生鸟类也可感染和携带CAV，就为该病更快速更大范围的传播提供了可能条件，导致CAV的防控更加困难。
　　为研究野生鸟类感染或携带CAV情况，本实验于2011-2012年从我国东北地区一些主要的野生动物疫源疫病监测站和鸟类环志站收集到野生鸟类样品共1199份，其中野生水禽以野鸭为主，共604份;陆生鸟类以雀形目的小型鸟为主，共595份。应用特异性PCR方法对收集样本进行了CAV感染情况的初步检测。随后将阳性样品接种在MDCC-MSB1细胞上进行病毒的分离培养，并应用特异性间接免疫荧光法(IFA)和特异性PCR方法对所分离的病毒进行系统鉴定，最后对鉴定为阳性的CAV分离株进行整个编码区的克隆和测序，并与Gen Bank上已发表的国内外CAV参考株进行了序列比对和分析。
　　实验结果表明，所有野生鸟类样品的CAV PCR阳性检出率为5.34％，其中野鸭阳性率为9.27％，小型鸟阳性率为1.34％。野生鸟类感染CAV不具明显的季节性，不同物种野鸟的CAV PCR阳性检出率不同。其中野鸭中以青头潜鸭、绿翅鸭阳性检出率最高;小型鸟中以淡脚柳莺阳性检出率最高。经MSB1细胞分离培养及间接免疫荧光鉴定，成功分离到野生鸟类CAV毒株14株，其中7株来自于野鸭，另7株来自于小型鸟，并对其分别命名。测序结果显示14株分离株编码区全长大小均为1823bp，无碱基的插入或缺失。VP1大小为1350bp，编码了449个氨基酸;VP2大小为651bp，编码了216个氨基酸;VP3大小为366bp，编码了121个氨基酸。序列分析表明，14株分离株之间的核苷酸同源性在98.2％-100％之间，野鸭分离株中有3株序列相同，其中WDNE110502株与其它分离株相比变异相对较大，而7株小型鸟分离株序列完全相同。分离株与德国标准毒株Cux-1等国内外参考株的整个编码区核苷酸同源性为95.2％-99.9％，氨基酸同源性为88.1％-99.8％，且均与国内毒株harbin同源性最高。遗传进化关系显示，所有CAV毒株分为两大分支，本实验所分离的14株野生鸟类毒株均处在同一大分支上，均与国内毒株harbin、C14亲缘关系较近;与另一分支上的澳大利亚毒株CAU269-7、3177亲缘关系较远。本研究从野生鸟类中分离出CAV，首次证实了CAV也可感染野生鸟类，这提示了我们野生鸟类在CAV的传播中可能起到一定作用。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 鸡贫血病毒的概况

1．2．1 发现和命名

1．2．2 病毒学分类

1．2．3 形态学结构

1．2．4 理化特性

1．2．5 基因组结构

1．2．6 DNA的复制

1．2．7 基因组的转录

1．2．8 结构蛋白与功能

1．2．9 鸡贫血病毒的诊断与检测

1．3 鸡贫血病毒的流行病学特征

1．3．1 CAV的发生与分布

1．3．2 CAV的宿主范围

1．3．3 CAV的传播途径

1．3．4 CAV的流行现状

1．4 野生鸟类感染的病毒性传染病的研究进展

1．5 本研究的目的和意义

2 东北地区野生鸟类感染鸡贫血病毒的流行病学调查

2．2 材料

2．2．1 实验样本

2．2．2 试剂和细胞

2．2．3 主要仪器

2．3 方法

2．3．1 样品的采集和处理

2．3．2 样品的PCR初步检测

2．3．3 病毒的分离和鉴定

2．4 结果

2．4．1 样品的PCR初步结果

2．4．2 病毒的分离和鉴定

2．4．3 CAV在野生鸟类的感染情况

2．5 讨论

3 野生鸟类CAV分离株编码区基因的克隆和序列分析

3．2 材料

3．2．1 CAV分离株

3．2．2 试剂和细胞

3．2．3 主要仪器和设备

3．3 方法

3．3．1 病毒DNA的提取

3．3．2 引物设计与合成

3．3．3 VP1、VP2基因的PCR扩增

3．3．4 PCR产物的回收纯化

3．3．5 目的片段与载体的连接

3．3．6 感受态细胞的制备

3．3．7 连接产物的转化

3．3．8 重组质粒的提取

3．3．9 重组质粒的鉴定

3．3．10 重组质粒的序列测定

3．3．11 VP1、VP2及VP3基因的序列分析

3．4 结果

3．4．1 VP1、VP2基因的PCR扩增结果

3．4．2 重组质粒的鉴定

3．4．3 序列测定结果

3．4．4 序列分析结果

3．5 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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