东北地区野生鸟类主要禽免疫抑制病病原感染情况调查及与REV PR相互作用宿主蛋白的筛选

摘要

近年来，禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)与J-亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis virus subgroup J，ALV-J)、鸡传染性贫血病毒(Chickeninfectious anemia virus， CAV)和马立克氏病病毒(Marek's disease virus， MDV)等几种免疫抑制性病毒的混合感染在养鸡场中普遍存在，使得鸡群免疫力低下，导致针对禽流感、新城疫等重要疫病的疫苗免疫失败，并容易造成继发感染，使疫病的诊断和防控难度加大。其中，有3大病毒性肿瘤病之称的禽白血病(AL)、禽网状内皮组织增生症(RE)和马立克氏病(MD)对禽类健康的危害甚为严重。针对上述病原的分子流行病学研究主要集中于家禽和水禽，很少有关野生鸟类的调查报道，且目前对野生鸟类携带病原的研究主要集中在禽流感病毒和新城疫病毒，国内外尚未见有关野生鸟类禽免疫抑制病病原的流行病学调查报道。野生鸟类作为许多病原携带者和自然宿主，可潜在传播人和动物的重要传染病。随着候鸟的迁徙，携带某些病毒的候鸟可能会将病毒传播到不同的地方而导致疾病的爆发和流行。因此，对野生鸟类进行常见病原的流行病学监测，具有重要的指示意义。为研究野生鸟类感染或携带禽免疫抑制病病原情况，本研究对2010年5月至2012年11月期间收集自东北三省部分地区的野生鸟类样品进行了几种常见禽免疫抑制病病原的分离鉴定及流行情况分析。样品来自于我国东北地区鸟类环志站和野生动物疫源疫病监测站，共收集到野生鸟类样品916份，其中野鸭样品581份;鸟类样品以雀形目的小型鸟为主，共335份。一方面进行了病毒的分离鉴定，调查了几种病原的感染流行情况;另一方面选取有代表性的毒株进行了基因克隆和分子遗传特征分析。
　　1.东北地区野生鸟类几种常见的禽免疫抑制病病原PCR检测
　　常规方法提取野鸟样品的DNA和RNA，用针对以下几种禽免疫抑制病病原的特异性PCR检测方法进行野鸟带毒情况初检:REV，ALV-A(Avian Leukosis virus subgroupA)，ALV-B(Avian Leukosis virus subgroup B)，ALV-J，CAV，MDV，禽传染性法氏囊病病毒(IBDV)以及禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)。实验结果表明野鸟存在REV，ALV-A，ALV-B，ALV-J以及CAV的感染。部分样品检测，没有发现MDV、IBDV和ARV的感染。所有野生鸟类样品的REV PCR阳性检出率为10.7％，其中野鸭阳性率为13.1％，小型鸟阳性率为6.6％; CAV PCR阳性检出率为4.1％; ALV-A PCR阳性检出率为4.35％; ALV-B PCR阳性检出率为6.4％;ALV-JPCR阳性检出率为6.8％;野生鸟类REV、ALV-A、ALV-B和ALV-J携带情况不具明显的季节性，不同种类野鸟的REV和ALV-J阳性检出率有一定差别。其中野鸭REV以针尾鸭阳性检出率最高，小型鸟中以长尾雀阳性检出率最高;ALV-J以凤头潜鸭阳性检出率最高，小型鸟以红肋蓝尾鸲阳性检出率最高。
　　2.东北地区野鸟源REV的分离鉴定及gp90基因遗传演化分析
　　将用REV PCR检测引物初筛为阳性的病料经适当处理后接种敏感细胞DF1培养增殖，进行病毒的分离。经特异性PCR和间接免疫荧光方法(IFA)鉴定，以及电镜检测，确定共分离到10株野鸟源REV，其中2株来源于小型鸟，其余8株分离自野鸭。对鉴定为阳性的REV分离株，对其保护性抗原基因gp90基因进行克隆和序列测定，与GenBank上已发表的REV参考株进行序列比对和分析。测序结果显示10株分离株的gp90大小为1191bp，编码了397个氨基酸;序列分析结果显示:10个REV分离株gp90基因氨基酸序列相似性为92.4％-100％;核苷酸遗传进化分析表明，所比对的序列明显地分三个分枝，每个分枝代表REV的3个不同亚型;10个野鸟源REV分离株与现有的东北分离株亲缘关系较近，位于同一分枝，趋于形成1个北方分离群;与美国和中国台湾地区的某些分离株同源性较高。与170A株和我国早期南方分离株HA9901亲缘关系较远;与SNV株亲缘关系最远。结果说明我国存在Ⅰ、Ⅲ2种亚型的REV，Ⅲ型是目前东北地区的家禽流行毒株，野鸟存在REV感染，且以Ⅲ型REV为主导。该研究首次自野鸟体内分离到REV，证明REV可感染野生鸟类。该研究结果既丰富了REV流行病学资料，同时也提醒我们重视野生鸟类迁徙在疾病传播中所扮演的角色，为深入研究REV致病机制、免疫抑制机制等奠定基础。
　　以提取的DBYR1102前病毒cDNA为模板，分段克隆DBYR1102基因组，并进行测序分析。结果显示，DBYR1102pol基因最保守，gag、 pol和env基因氨基酸序列与中国北方禽源分离株相似性较高，属于Ⅲ型REV。
　　3.东北地区野鸟源ALV-J分离鉴定及gp85基因遗传演化分析
　　通过特异性PCR、间接ELISA抗原检测和IFA等方法，确定共分离到6株野鸟源ALV-J，其中4株来自野鸭，2株来源于野生小鸟。克隆6个野鸟源ALV-J分离株的主要保护性抗原基因gp85，并进行序列比对和遗传进化分析，结果发现野鸟源ALV-J分离株gp85基因ORF为921-924bp，分别编码307和308个氨基酸。各毒株gp85基因编码氨基酸序列同源性为81.2％～99.7％。毒株DBYJ1102， DBYJ1103， DBYJ1004和DBYJ106之间表现出高度的序列相似性，与近几年ALV-J蛋鸡分离株的推导氨基酸序列同源性较高，进化树显示处于同一分支，被称为Ⅰ群;而毒株DBYJ1101和DBYJ1105之间相似性较高，与原型株HPRS-103、美国代表毒株UD5以及大多数的肉鸡分离株的推导氨基酸序列表现出较高的同源性，共处于同一分支，被称为Ⅱ群。以上结果表明，6株ALV-J野鸟分离株gp85基因变异较大，其中两株与ALV-J英国肉鸡原型毒株HPRS-103株亲缘关系较近，另外4株与中国近几年蛋鸡分离株亲缘关系较近。提示野鸟毒株的遗传演化变异。
　　4.REV p30蛋白的表达、纯化及间接ELISA检测方法的初步建立
　　扩增REV p30基因，将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，构建原核表达质粒pET30-p30，转化BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导，通过Western blot检测，p30蛋白在表达上清中呈可溶性表达。利用Ni-NTA His Bind Resin纯化重组蛋白，并用蔗糖浓缩重组蛋白，免疫新西兰白兔，制备兔抗p30多抗。SDS-PAGE及western blot结果表明，p30蛋白获得正确表达，表达产物具有良好免疫原性。制备的多克隆抗体的效价约为1∶25600，以纯化的重组蛋白作为包被抗原，在包被量为3.2μg/孔、血清1∶250倍稀释条件下，P/N值最大，初步建立了REV抗体间接ELISA检测方法。该研究为REV的检测及p30基因的深入研究奠定了基础。
　　5.酵母双杂交筛选与REV聚合酶PR相互作用的宿主蛋白
　　研究与REV相互作用的宿主细胞蛋白对研究PR蛋白的功能、REV致病性以及感染机制等方面具有重要意义。本研究以REV PR为诱饵蛋白，利用酵母双杂交系统从本实验室构建的鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast，CEF) cDNA酵母表达文库中筛选得到与REV聚合酶PR相互作用的宿主细胞蛋白，并通过酵母回返验证实验，证明了PR与Snapin在酵母细胞中存在相互作用。本实验构建了pGBKT7-PR酵母双杂交诱饵质粒，转化酵母菌，结果表明诱饵质粒没有自激活活性和毒性。用诱饵质粒筛选CEF cDNA文库，通过对阳性文库质粒插入片段测序分析，得到与PR相互作用的宿主蛋白ATP1B1和Snapin。已有研究表明Snapin蛋白参与细胞多种生化过程，并能发挥抗病毒作用。利用酵母菌Y2H进行回返验证，结果表明在酵母系统中，Snapin和PR存在相互作用。从CEF细胞成功扩增Snapin的基因，构建了带有Flag标签的pCAGGS-Snapin真核表达载体和带有HA标签的pCAGGS-PR真核表达载体。以上结果不仅为进一步通过免疫共沉淀（coimmunoprecipitation，Co-IP）验证PR和Snapin的相互作用提供了依据。同时为深入研究REV与宿主相互作用奠定了基础。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 REV病原学、分子病毒学及流行情况

1．2．1 病原学

1．2．2 基因结构及编码蛋白

1．2．3 流行病学

1．2．4 REV的危害

1．3 ALV-J病原学、分子病毒学及流行情况

1．3．1 ALV病毒亚型分类

1．3．2 ALV-J基因结构及编码蛋白

1．3．3 ALV-J流行病学研究

1．4 野鸟在动物病毒传播中的作用及意义

1．5 蛋白相互作用研究方法

1．5．1 酵母双杂交技术

1．5．2 噬菌体展示技术

1．5．3 免疫共沉淀技术

1．5．4 Pulldown技术

1．5．5 荧光共振能量转移

1．6 Snapin蛋白研究概况

1．7 本研究的目的和意义

2 东北地区野生鸟类禽免疫抑制病病原感染情况调查

2．1 实验材料和实验仪器

2．1．1 病料、病毒和细胞

2．1．2 菌株、载体

2．1．3 主要试剂及试剂盒

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 样品采集及处理

2．2．2 病毒基因组DNA和RNA提取

2．2．3 禽免疫抑制病病原的特异性PCR检测

2．2．4 野鸟源REV分离及gp90基因遗传演化分析

2．2．5 野鸟源ALV-J分离及gp85基因遗传演化分析

2．3 结果

2．3．1 禽免疫抑制病病原PCR检测结果

2．3．2 野鸟源REV分离鉴定

2．3．3 野鸟源REV gp90基因序列分析及遗传演化分析

2．3．4 DBYR1102全基因组克隆及序列分析

2．3．5 野鸟源ALV-J分离鉴定

2．4 讨论

3 REV p30蛋白的表达纯化及ELISA检测方法的初步建立

3．1 材料

3．1．1 病毒株、质粒、菌株和实验动物

3．1．2 主要试剂及仪器

3．2 方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 DNA的提取及p30基因的扩增

3．2．3 重组表达质粒的构建与鉴定

3．2．4 重组蛋白的诱导表达与鉴定

3．2．5 重组蛋白的纯化与浓缩

3．2．6 融合蛋白的Western blot鉴定

3．2．7 抗REV-p30基因多克隆抗体的制备及生物学活性检测

3．2．8 间接ELISA检测方法的初步建立

3．2．9 间接ELISA检测方法的初步应用

3．3 结果

3．3．1 REVp30蛋白的原核表达及蛋白纯化

3．3．2 重组p30蛋白的表达与鉴定

3．3．3 重组蛋白纯化与浓缩

3．3．4 融合蛋白Western blot鉴定

3．3．5 多克隆抗体的制备及检测

3．3．6 融合蛋白的间接ELISA检测结果

3．4 讨论

4 酵母双杂交筛选与REV聚合酶PR相互作用的宿主蛋白

4．1 材料

4．1．1 毒株、细胞、文库、抗体及质粒

4．1．2 主要仪器

4．1．3 主要试剂、耗材

4．1．4 毒株、细胞、文库、抗体及质粒主要培养基及培养液配制

4．2 方法

4．2．1 PR诱饵载体的构建

4．2．2 pGBK-PR诱饵载体自激活性与毒性检测

4．2．3 酵母双杂交筛选

4．2．4 酵母共转化试验

4．2．5 酵母菌转化

4．2．6 Snapin真核表达载体构建

4．3 实验结果

4．3．1 PR-pGBKT7诱饵质粒的构建

4．3．2 pGBPR诱饵质粒自激活性与毒性检测

4．3．3 文库滴度检测

4．3．4 杂交效率检测

4．3．5 回转验证实验结果

4．3．6 Snapin基因的扩增与酶切鉴定

4．3．7 PR真核表达质粒酶切鉴定

4．4 讨论

4．4．1 文库构建与质量鉴定

4．4．2 诱饵质粒构建与检测

4．4．3 文库筛选

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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