牡丹种皮黄酮提取分离与抗氧化及抗疲劳作用研究

摘要

牡丹种皮是牡丹籽油生产过程中的废弃物，占牡丹种子质量的三分之一，虽然生物量很大，但目前还没有有效的开发利用。笔者从牡丹种皮中提取黄酮类化合物，为其变废为宝、发展循环经济和提高牡丹籽油产品附加值发展新的研究方向。本文首先研究了使用匀浆提取和酶辅助匀浆提取技术提取牡丹种皮总黄酮的工艺，研究了工艺参数和提取率之间的关系，确定了酶辅助匀浆法提取牡丹种皮总黄酮的最佳工艺参数。优化了大孔树脂吸附分离牡丹种皮黄酮的工艺条件，采用多种方法研究了牡丹种皮黄酮的体外抗氧化活性，对小鼠体内抗氧化和抗疲劳作用的相关指标进行分析，主要研究内容如下:
　　1.以总黄酮和木犀草素提取率为考察指标，分析了酶辅助匀浆法与传统匀浆法两种提取工艺对牡丹种皮黄酮和木犀草素的提取效果。在最佳匀浆条件下，所得黄酮浓度最高可达49.82mg/g。进行酶浓度和种类以及酶解孵育条件筛选后，得出果胶酶的效果好于纤维素酶和混合酶，果胶酶浓度最佳为0.05mg/mL，所得黄酮浓度最高可达74.66mg/g，相比于匀浆法所得黄酮含量高出33％。在最佳匀浆条件下，木犀草素含量最高可达0.75mg/g，酶辅助匀浆法所得木犀草素含量最高为3.20mg/g，是匀浆法所得木犀草素含量的四倍。所以酶辅助匀浆法能够高效提取牡丹种皮黄酮和木犀草素。
　　2.用大孔树脂对提取物进行了初步纯化，探讨了适宜的纯化条件。研究了7种树脂的静态和动态的吸附和解吸动力学，确定D101最佳吸附条件为上样流速控制为1mL/min，上样液浓度为4 mg/mL，上样液的pH为6。而最佳的洗脱条件为:用浓度为80％的乙醇洗脱，洗脱速率控制在1.2 mL/min。按照以上最优的牡丹种皮黄酮提取物大孔树脂纯化条件，总黄酮含量由纯化前的7.47％增加到纯化后的46.66％，木犀草素含量由纯化前的3.2‰增加到纯化后的2.08％，纯度都提高了6倍。
　　3.为了研究牡丹种皮黄酮的抗氧化作用，本研究通过体外抗氧化实验，测定了牡丹种皮黄酮和木犀草素的总还原能力和对生物体内常见的DPPH·和ABTS·自由基的清除能力，以及Fe3+的还原能力，同时与2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)进行了比照。通过上述体外抗氧化能力评价体系的实验结果显示，牡丹种皮黄酮和木犀草素的总还原能力和对于DPPH·和ABTS·自由基的清除能力和Fe3+的还原能力都强于BHT，木犀草素的抗氧化能力强于牡丹种皮黄酮。通过上述抗氧化能力分析体系，说明牡丹种皮黄酮和木犀草素都是一种很好的天然抗氧化剂，而且牡丹种皮黄酮的抗氧化能力与其所含有的木犀草素密切相关。
　　4.本文对牡丹种皮黄酮的体内抗氧化作用进行了系统研究。实验结果表明，牡丹种皮黄酮高剂量组、中等剂量组和维生素E组相对于空白组可以显著提高小鼠的血清、肝和肾组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活力，说明高剂量组和中等剂量组具有抵御膜脂质过氧化和清除血清、肝和肾组织中自由基的能力。并且高剂量组的肝组织中的丙二醛(MDA)含量、SOD、CAT和GSH-PX的活力与维生素E组差异不显著。说明牡丹种皮黄酮高剂量组在保护膜脂质过氧化和清除体内自由基能力与维生素E组相当，进一步表明牡丹种皮黄酮具有体内抗氧化活性。
　　5.本研究根据疲劳产生的机理，从宏观上，通过小鼠负重游泳力竭实验证明了牡丹种皮黄酮提取物高剂量组和中等剂量组与二十八烷醇组均能显著延长小鼠的负重游泳时间。相比于空白组，高剂量组负重游泳时间延长率为87.5％，中等剂量组延长率为52.5％，二十八烷醇组延长率为40％。从各种生化指标的检测来看，牡丹种皮黄酮提取物的高剂量组相比于二十八烷醇能明显降低小鼠运动后血清尿素氮(BUN)和血乳酸(BLA)含量，提高肝糖原(LG)和肌糖原(MG)储备。说明牡丹种皮黄酮可以使小鼠机体耐力增强，承受运动负荷能力加强，所以高剂量的牡丹种皮黄酮具有抗疲劳作用，其抗疲劳作用强于二十八烷醇。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 牡丹生物学特性及分布

1．2．1 牡丹的形态学特征

1．2．2 牡丹的地域分布

1．3 牡丹的成分及功能研究进展

1．3．1 牡丹花的化学成分及功能

1．3．2 牡丹籽的化学成分及功能

1．3．3 牡丹皮的化学成分及功能

1．3．4 牡丹花粉的化学成分及功能

1．4 黄酮类化合物研究进展

1．4．1 黄酮类化合物结构与分类

1．4．2 黄酮类化合物的理化性质

1．4．3 黄酮类化合物的分离提取

1．4．4 黄酮类化合物的分离纯化

1．4．5 黄酮类化合物的分析测定

1．4．6 黄酮类化合物的生物活性

1．5 本研究目的、意义及研究内容

2 酶辅助法匀浆提取牡丹种皮黄酮工艺的研究

2．1 实验材料与仪器

2．2 实验方法

2．2．1 总黄酮含量测定方法

2．2．2 木犀草素HPLC分析测定方法

2．2．3 匀浆提取工艺条件优化

2．2．4 酶辅助法提取工艺条件优化

2．3 结果与分析

2．3．1 牡丹种皮黄酮和木犀草素检测方法的建立

2．3．2 木犀草素HPLC分析测定方法

2．3．3 牡丹种皮黄酮的最佳匀浆提取工艺筛选

2．3．4 牡丹种皮黄酮和木犀草素的最佳酶辅助匀浆提取工艺筛选

2．4 本章小结

3 大孔树脂吸附柱层析法分离纯化牡丹种皮黄酮的研究

3．1 材料与仪器

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 牡丹种皮黄酮提取液制备

3．2．2 牡丹种皮黄酮和木犀草素含量测定

3．2．3 大孔树脂预处理

3．2．4 大孔树脂的静态吸附解吸实验

3．2．5 大孔吸附树脂D101对牡丹种皮黄酮的纯化条件的确定

3．3 结果与分析

3．3．1 大孔吸附树脂的筛选

3．3．2 大孔吸附树脂D101对牡丹种皮黄酮的纯化条件

3．3．3 牡丹种皮总黄酮和木犀草素纯化前后含量变化

3．4 本章小结

4 牡丹种皮黄酮体外抗氧化性能研究

4．1 实验材料与设备

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 实验仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 牡丹种皮黄酮溶液和对照品溶液的制备

4．2．2 牡丹种皮黄酮体外抗氧化实验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 牡丹种皮黄酮总还原能力

4．3．2 牡丹种皮黄酮对DPPH·自由基清除效果

4．3．3 牡丹种皮黄酮清除ABTS·自由基的活力测定

4．3．4 牡丹种皮黄酮对Fe3+的还原能力

4．4 本章小结

5 牡丹种皮黄酮对小鼠体内抗氧化作用研究

5．1 实验材料与仪器

5．1．1 实验材料

5．1．2 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．1 抗氧化实验体系的建立

5．2．2 血清和组织样品处理

5．2．3 检测指标

5．2．4 统计分析

5．3 结果与分析

5．3．1 各组小鼠的体重和器官指数

5．3．2 各组小鼠血清、肝及肾组织SOD活力

5．3．3 各组小鼠血清、肝及肾组织MDA含量

5．3．4 小鼠肝和肾组织匀浆总蛋白含量

5．3．5 小鼠肝和肾组织CAT活性

5．3．6 小鼠肝和肾组织GSH-PX活力

5．4 本章小结

6 牡丹种皮黄酮的抗疲劳功能研究

6．1 实验材料与仪器

6．1．1 实验材料

6．1．2 主要仪器

6．2 实验方法

6．2．1 建立抗疲劳实验体系

6．2．2 负重游泳实验及测定力竭游泳时间

6．2．3 血尿素氮(BUN)、血乳酸(BLA)含量的测定

6．2．4 肝糖原(LG)和肌糖原(MG)含量的测定

6．2．5 数据分析

6．3 结果与讨论

6．3．1 牡丹种皮黄酮对小鼠的体重和器官指数的影响

6．3．2 牡丹种皮黄酮对小鼠负重游泳时间的影响

6．3．3 牡丹种皮黄酮对小鼠血清尿素氮(BUN)和血乳酸(BLA)的影响

6．3．4 牡丹种皮黄酮对小鼠肝糖原(LG)和肌糖原(MG)的影响

6．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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