ICSI技术挽救GFP兔及介导家兔转基因的研究

摘要

目的：探索电刺激家兔卵母细胞对ICSI过程卵的激活和胚胎发育效果的影响，检验从死亡GFP兔获得精子通过ICSI方法能否生产整期发育的家兔，并对碱处理精子进行家兔ICSI介导转基因进行初步研究。
　　方法：精子从死亡大约5小时后的杂合子GFP公兔收集并冻存（5个月大），通过解冻后用于ICSI。成熟的新西兰兔通过注射HCG使其超数排卵，收集14-15小时的卵母细胞。采用显微单精子注射技术，把精子注入卵母细胞卵质。在ICSI操作之前或之后卵的激活采用直流电动脉冲程序。ICSI后，受精卵在B2液培养4天或在2-4细胞时期移植到受体的输卵管内。此外，实验采用10mM NaOH碱处理家兔精子使精子破膜后，与外源基因共同孵育，然后通过ICSI技术导入卵母细胞。实验另设无碱处理无质粒孵育组和碱处理后精子无质粒孵育空白组，观察并比较胚胎的发育情况。
　　结果：ICSI前一次电击组和前两次电击组囊胚率没有显著性差异(34％ VS37％)，但这两组囊胚率显著高于其他组，而且ICSI前一次电击组平均23％的囊胚表达GFP荧光—远远超过其他组。在这两个ICSI空白对照组，注射前两次电击组卵的孤雌发育更高(40 VS0％，P＜0.05)。同时，注射前一次电击加注射后一次电击组和注射后一次电击组胚胎的存活率显著下降（48％和47％）。最后来自注射前一次电击组的93枚胚胎移植给4个受体，有一个受体怀孕，而且得到整期发育的胎儿。另外，实验结果显示精子碱处理与质粒孵育对胚胎的发育无显著影响（P＜0.05），ICSI介导转基因后观察囊胚出现绿色荧光，占总囊胚数的34.78％，外源性DNA的转入率为19.51％。
　　结论：本实验证实了注射前一次电击是激活卵的有效方法。来自死亡GFP兔的精子可以支持ICSI胚胎的整期发育。初步建立了关于家兔ICSI转基因的方法。

目录

摘要

1 引言

1．1 ICSI技术的研究进展

1．1．1 家兔ICSI技术

1．1．2 牛ICSI技术

1．1．3 人ICSI技术

1．1．4 小鼠ICSI技术

1．1．5 羊ICSI技术

1．1．6 猪ICSl技术

1．1．7 马ICSI技术

1．1．8 猴ICSI技术

1．2 ICSI技术的应用现状

1．2．1 治疗男性不育

1．2．2 ICSI转基因的应用

1．3 ICSI技术的发展前景

1．3．1 应用于性别控制

1．3．2 与ES技术相结合

1．3．3 提高卵母细胞的受精率

1．3．4 提高珍稀动物精子利用率

1．3．5 在胚胎早期基因甲基化的研究

1．4 研究的目的和意义

2 ICSI挽救转基因兔

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 动物来源

2．2．2 试剂和仪器

2．2．3 方法

2．2．4 数据分析

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 ICSI介导家兔转基因的初步研究

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 实验动物

3．2．2 主要试剂和仪器

3．2．3 实验方法

3．2．4 数据分析

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明