单精子胞质内注射转基因法(ICSI-MGT)生产转Fat-1基因兔的初步研究

摘要

单精子胞质内注射转基因(Intracytoplasmic Sperm Injection Mediated Gene Transfer,ICSI-MGT)是精子载体转基因中应用最广泛的一种方法,它具有不需要考虑精子的活力、能转移大片段的外源基因和相对于体外受精介导有较高的转基因效率等优点,因此被广泛应用于转基因动物制作研究。本研究以线虫体内克隆获得的n-3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因(Fat-1)为目的基因,系统研究了兔 ICSI-MGT转基因效率的相关影响因素和精子/DNA结合的分子机制,并对应用ICSI-MGT生产转Fat-1基因兔的可行性进行了探讨。
　　1、研究了兔精子处理方法对ICSI-MGT转基因效率的影响。结果发现,无抗冻剂液氮长期冻存对精子DNA的损伤程度与一次液氮冻融组相比无显著差异(P>0.05),其受精后的合子双原核形成率(71.4％ vs67.5%和77.2%)、卵裂率(76.7%vs79.5%和80.4%)及囊胚率(39.7%vs42.0%和40.2%)与一次液氮冻融组及新鲜精子组相比均无显著差异(P>0.05),但其ICSI-MGT后的阳性胚胎率及囊胚阳性率显著高于新鲜精子组(43.8%vs18.6%;56.1% vs12.8%,P<0.05),而与一次液氮冻融精子组无显著差异(43.8% vs40.2%;56.1% vs46.8%,P>0.05)。比较不同来源精子的ICSI-MGT转基因效率时发现,来自附睾的精子与采集的精子相比,其与外源DNA结合的效率差异极为显著(DNaseI消化前:77.5%vs17.0%;DNaseI消化后:47.6% vs5.2%,P<0.01),ICSI-MGT后能获得较高的阳性胚胎率和囊胚阳性率(32.4%vs10.8%;40.2%vs9.2%,P<0.05);对二者精液的差异成份——精浆进行分析,发现外源质粒孵育精浆后出现降解现象且降解程度随着其含量的升高而逐步升高,当精子/DNA孵育体系中添加EDTA后能显著抑制孵育外源质粒的降解,同时,EDTA处理后的采集精子用于ICSI-MGT生产转基因胚胎,与未添加EDTA对照组相比能显著提高阳性胚胎率及囊胚阳性率(24.5%vs10.8%;36.0%vs9.2%;P<0.05)。上述结果表明:(1)无抗冻剂液氮长期冻存精子可以用于 ICSI-MGT操作生产转基因胚胎,为兔精子介导转基因提供了一种方便可靠的精子保存方法;(2)精浆成份存在高活性的脱氧核糖核酸酶能降解外源 DNA从而降低ICSI-MGT的转基因效率,添加 EDTA能抑制外源 DNA的降解进而提高ICSI-MGT的转基因效率。
　　2、探讨了ICSI兔卵母细胞激活与培养对胚胎发育的影响。激活方法对比研究的结果显示,ICSI卵母细胞经5μM Ion激活5 min后,再用2 mM6-DMAP或2 mM6-DMAP+5μg/mL CHX培养1.5 h,其分裂率高于用5μg/mL CHX培养1.5 h的卵母细胞和未激活对照的卵母细胞,卵母细胞激活后用2 mM6-DMAP+5μg/mL CHX培养1.5 h的囊胚率(41.3%)和一级胚胎率(65.4%)显著高于其它各组的卵母细胞(P<0.05);胚胎分级后进行常规体外培养,一级胚胎的囊胚率和囊胚细胞数与体内胚胎差异不显著(P>0.05),显著高于二级、三级胚胎(P<0.05)。当在培养液中添加不同浓度的细胞凋亡抑制剂1-磷酸-鞘氨醇(S1P)时,添加50 nM或100 nM的S1P能提高囊胚形成率和囊胚质量(P<0.05),100 nM S1P组的整二倍体(2n=44)囊胚比例显著高于不添加的对照组(94.7%vs78.6%,P<0.05);检测二级碎裂胚胎细胞微丝蛋白分布发现:胚胎经100 nM S1P处理的各阶段细胞微丝蛋白在细胞间隙及内细胞团处呈现集中分布,但未处理培养组的碎裂二级胚胎各阶段细胞微丝蛋白松散、无规则排列,内细胞团处无明显聚集。上述结果表明:(1)ICSI兔卵母细胞的适宜激活处理方法是 Ion激活5 min,再用6-DMAP和CHX培养1.5 h;(2)细胞凋亡抑制剂S1P能提高ICSI胚胎的体外培养质量、降低胚胎碎裂程度、维持胚胎细胞染色体的正常倍性并对细胞骨架微丝蛋白的正常分布有调节作用。
　　3、探讨了 ICSI-MGT转基因兔胚胎生产的相关影响因素(质粒浓度和构型),并建立了转Fat-1基因的家兔模型。结果发现,随着pPGK1/Fat-1-CMV/EGF质粒浓度的升高,兔精子结合质粒的效率在DNaseI消化前后均呈上升趋势,且 ICSI-MGT的阳性胚胎率也随着质粒浓度的升高而提高,但当浓度达到500 ng/μL时,胚胎的分裂率和囊胚率与其他各组相比均显著降低,而30 ng/μL组的囊胚率显著高于50 ng/μL组(49.0% vs33.3%,P<0.05),且其阳性胚胎率、囊胚阳性率显著高于10 ng/μL和15 ng/μL组(56.3%vs45.6%和21.2%;55.3%vs39.0%和33.3%,P<0.05)。对与不同浓度质粒孵育后的精子基因组进行琼脂糖凝胶电泳发现,随着外源质粒浓度的升高精子基因组发生降解而使胚胎发育能力受到影响。在研究线状/环状质粒的不同比例对转基因效率的影响时发现:比例为1:1的线状/环状质粒在精子结合效率和胚胎转基因效率上均显著高于1:0、1:4和0:1组(P<0.05)。将281枚2～8细胞期阳性胚胎分别移植到10只同期发情受体或供体兔自体移植,结果共有两只受体妊娠,生产出7只仔兔(编号1～7);采用组织切片激光共聚焦扫描显微镜、PCR、RT-PCR、Southern Blotting、Western Blotting分子生物学方法和气-质联用技术(GC-MS)对仔兔进行转基因鉴定,发现除编号3的仔兔外,其余六只均有pPGK1/Fat-1-CMV/EGFP质粒的报告基因元件EGFP及目的基因Fat-1的表达,且仔兔肌肉组织n-3多不饱和脂肪酸的相对含量有大幅提高,n-6多不饱和脂肪酸的含量则大幅下降,n-6/n-3 PUFAs的比值由野生型的约17.5±1.4下降到转基因组的0.6±0.1～1.9±0.1左右。上述结果表明:(1)质粒的浓度和线状/环状比例影响兔ICSI-MGT的转基因效率,以浓度为30 ng/μL和1:1的线状/环状比例能获得较好的转基因效率;(2)采用ICSI-MGT方法能获得整合并且表达Fat-1基因的的转基因兔,并且能降低n-6/n-3 PUFAs的比值。
　　4、采用非变性PAGE电泳对DNA/精子蛋白质共孵育复合物和精子自由蛋白质进行分离联合质谱技术初步探讨了精子与外源 DNA相互结合的分子机制。结果发现,DNA/精子蛋白质共孵育复合物泳道出现一条蛋白质-DNA结合的滞后带,对该条带进行质谱分析获得7个蛋白质,通过理化性质和蛋白保守区域分析发现其中的IAM38蛋白质均符合DBPs的性质,进一步SMART在线对7个蛋白质的功能结构域进行分析,发现仅IAM38具有若干免疫球蛋白IG结合位点及蛋白质与DNA相互作用的结构功能单元(包括锌指结构、亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋结构)。Western Blotting结果显示免疫球家族蛋白CD4分子在精子中有分布,但在精浆中并不存在;利用 CD4分子单克隆抗体对兔精子CD4分子功能位点进行封闭后再与pPGK1/Fat-1-CMV/EGFP质粒共孵育,原位杂交结果显示:兔精子经 CD4分子抗体封闭后与未封闭组相比不影响其与外源DNA的携带能力(68.3%vs75.7%,P>0.05),但极显著地降低了外源DNA的内化(7.5%vs51.4%,P<0.01)。将CD4分子单克隆抗体封闭后的精子进行ICSI-MGT,发现封闭后的兔精子ICSI-MGT胚胎的分裂率和囊胚率与未封闭对照组相比虽然无显著差异(70.5%vs76.7%;39.7%vs32.6%;P>0.05),但阳性胚胎率及囊胚阳性率均极显著低于未封闭组(7.8% vs43.8%;7.1% vs56.1%,P<0.01)。上述结果表明:精子结合外源DNA模式为首先外源DNA与精子质膜的跨膜蛋白质IAM38结合,然后二者依赖免疫球蛋白的同噬性与CD4分子形成DNA/IAM38/CD4复合物完成DNA入核转运。

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第一章 精子载体介导转基因法及n-3 PUFAs的研究进展

1. 精子载体法转基因研究进展

2 多不饱和脂肪酸的研究进展与转基因工程研究

3 研究前景及本课题的意义

第二章 兔精子处理方法对ICSI-MGT转基因效率的影响

2 结果

3 讨论

4 结论

第三章 兔ICSI激活方法与培养对胚胎发育的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第四章 转Fat-1基因兔模型的制备与检测

1 材料与方法

3 讨论

4 结论

第五章 精子结合外源DNA分子机制的初步研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

致谢