龙葵果花色苷分离、降解特性及体外抗氧化活性研究

摘要

本研究选用成熟龙葵果作为试验原料，考察花色苷的提取工艺，分离纯化工艺，并对分离得到的花色苷组分进行结构鉴定。研究pH和温度对龙葵果花色苷不同提取物降解的影响，研究干燥的花色苷粉末在不同贮藏温度下的降解规律及半衰期。比较真空冻干和低温烘干对花色苷粗提物、精制物、组分Ⅰ和组分Ⅱ的抗氧化活性影响。
　　试验采用溶剂浸提法对龙葵果花色苷进行提取。选取14种提取溶剂，分析不同溶剂提取物中总酚、黄酮和花色苷的提取得率及抗氧化活性之间的相关性。在单因素试验的基础上，运用全因子试验设计、最陡爬坡试验设计和中心旋转组合试验设计进行响应面分析。结果显示，60％乙醇为最佳提取溶剂，其总酚、黄酮和花色苷的提取得率分别为1.99±0.03、1.02±0.01、0.82±0.02mg/g;60％乙醇提取物对ABTS+·和·OH的清除率分别为88.18±0.59％和82.45％±0.59％，总还原能力为5.45±0.06mmol/L FeSO4当量。总酚含量与抗氧化活性的相关性最大，黄酮次之，花色苷最小，总酚含量与抗氧化活性的相关系数分别为0.959（总还原能力），0.627（清除·OH能力）和0.822（清除ABTS+·能力）。花色苷的最佳提取工艺条件为:提取液pH1.0，提取温度29℃，提取时间85.5min，料液比1∶25，在此条件下花色苷的提取得率为0.86±0.03mg/g。
　　通过静态吸附和解吸附筛选花色苷最佳纯化树脂，通过动态吸附和解吸附得出最佳纯化工艺。结果显示，X-5为龙葵果花色苷纯化的最佳吸附介质，其最优条件为:层析柱径长比为1∶25，最大上样量为0.6BV，洗脱剂体积为3.5BV，上样浓度为0.4mg/mL，用pH2.060％乙醇做洗脱剂，最佳洗脱流速为2.0BV/h，纯化后的花色苷纯度为纯化前的19倍。
　　采用薄层层析法筛选最佳的展开剂，确定正丁醇∶冰乙酸∶水=4∶1∶3为最佳的展开剂。硅胶柱层析法从龙葵果花色苷提取物中分离出一个蓝色组分和一个红色组分。用HPLC-DAD-ESI-MS/MS技术分析花色苷组成，并且利用酸水解和HPLC-RID技术鉴定糖苷种类。经鉴定组分Ⅰ为单体花色苷飞燕草素-3-琥珀酰-阿拉伯糖苷，纯度为94％，组分Ⅱ含有两种花色苷，分别为矢车菊素-3-半乳糖苷和矢车菊素-3-乙酰-半乳糖苷。
　　通过研究龙葵果花色苷粗提物、精制物、组分Ⅰ和组分Ⅱ在不同pH和温度下的降解过程，得出其降解规律。结果显示，龙葵果花色苷的降解符合一级反应动力学模型。相同pH下随着温度的升高龙葵果花色苷的降解速率常数呈现指数型增长趋势，半衰期呈现指数型下降趋势。60℃和70℃时随着pH的增大，粗提物、精制物的降解速率常数呈现对数型增长趋势，而组分Ⅰ和组分Ⅱ的降解速率常数则呈现指数型增长趋势，4种提取物的半衰期均呈现指数型下降的趋势。而80℃和90℃时，4种花色苷提取物的降解速率常数和半衰期并未呈现规律性的变化。4种龙葵果花色苷提取物均在60℃pH1.0时降解最慢，稳定性最好，其中粗提物的稳定性最强。
　　通过研究真空冻干和低温烘干对花色苷降解的影响，得出真空冻干有利于花色苷的稳定。干制后的花色苷粗提物降解速率最快半衰期最短，组分Ⅱ降解速率最慢半衰期最长。组分Ⅰ即分离得到的单体花色苷即飞燕草素-3-琥珀酰-阿拉伯糖苷在-18℃下的半衰期可长达80.6周。
　　测定不同花色苷提取物对DPPH·和ABTS+·的清除能力，同时测定总还原能力及抑制脂质过氧化能力，选择芦丁和Trlolox做阳性对照。并且比较了低温烘干和真空冻干对不同提取物抗氧化活性的影响。结果显示，粗提物表现出最强的清除自由基能力和总还原能力，其液态下IC50值分别为33.35±0.02μg/mL和24.92±0.12μg/mL;总还原能为9.25±0.19mmol/LFeSO4。组分Ⅰ和组分Ⅱ表现出较强的抑制脂质过氧化的能力，其液态下IC50值分别为0.26±0.02μg/mL和25.08±0.05μg/mL。干制可显著提高龙葵果花色苷的抗氧化活性，真空冻干提取物较低温烘干提取物的抗氧化活性略强。

目录

摘要

1 绪论

1．1 龙葵简介

1．2 花色苷的结构

1．3 花色苷的提取技术

1．3．1 溶剂浸提法

1．3．2 双水相萃取技术

1．3．3 离子液体萃取技术

1．3．4 生物工程辅助提取技术

1．4 花色苷的分离纯化方法

1．4．1 纸层析

4．4．2 薄层层析

1．4．3 柱层析

1．4．4 高效液相色谱法

1．5 花色苷的分析鉴定

1．5．1 紫外-可见光谱法

1．5．2 高效液相色谱-质谱联用法

1．6 花色苷稳定性的影响因素

1．6．1 花色苷自身结构

1．6．2 pH

1．6．3 温度

1．6．4 辅色作用

1．7 花色苷的体外抗氧化活性研究

1．7．1 清除自由基的能力

1．7．2 总还原能力(FRAP法)

1．7．3 抑制脂质过氧化的能力

1．8 本研究的目的及意义

1．9 本研究的主要内容

2 龙葵果花色苷的提取

2．1 引言

2．2 试验材料

2．2．1 原料

2．2．2 试剂

2．2．3 仪器

2．3 试验方法

2．3．1 提取方法

2．3．2 不同溶剂提取物体外抗氧化活性测定

2．3．3 不同溶剂活性物质提取得率的测定

2．3．4 龙葵果花色苷提取的单因素试验

2．3．5 响应面法优化龙葵果花色苷提取工艺

2．3．6 数据分析

2．4 结果与分析

2．4．1 不同溶剂活性物质提取得率及抗氧化活性测定结果与分析

2．4．2 活性物质提取得率与抗氧化活性的相关性分析

2．4．3 花色苷提取单因素试验结果与分析

2．4．4 响应面法优化龙葵果花色苷提取工艺结果与分析

2．5 讨论

2．6 本章小结

3 龙葵果花色苷的分离纯化及结构鉴定

3．1 引言

3．2 试验材料

3．2．1 试剂

3．2．2 仪器

3．3 试验方法

3．3．1 龙葵果花色苷的纯化方法

3．3．2 龙葵果花色苷的分离方法

3．3．3 龙葵果花色苷的结构鉴定

3．3．4 数据分析

3．4 结果与分析

3．4．1 龙葵果花色苷纯化工艺结果与分析

3．4．2 展开剂的筛选结果与分析

3．4．3 龙葵果花色苷的结构鉴定结果与分析

3．5 讨论

3．6 本章小结

4 龙葵果花色苷的降解特性

4．1 引言

4．2 试验材料

4．2．1 试剂

4．2．2 仪器

4．3 试验方法

4．3．1 不同pH龙葵果花色苷提取物溶液的配制

4．3．2 pH和温度对龙葵果花色苷不同提取物降解的影响

4．3．3 贮藏温度对龙葵果花色苷降解的影响

4．3．4 数据分析

4．4 结果与分析

4．4．1 pH和温度对龙葵果花色苷粗提物降解的解影响

4．4．2 pH和温度对龙葵果花色苷精制物降解的影响

4．4．3 pH和温度对龙葵果花色苷组分降解的影响

4．5 讨论

4．6 本章小结

5 龙葵果花色苷的体外抗氧化活性

5．1 引言

5．2 试验材料

5．2．1 试剂

5．2．2 仪器

5．3 试验方法

5．3．1 不同花色苷样品的制备

5．3．2 不同花色苷样品对DPPH·的清除能力

5．3．3 不同花色苷样品对ABTS+·的清除能力

5．3．4 不同花色苷样品总还原力的测定

5．3．5 不同花色苷样品抑制脂质过氧化能力测定

5．4 结果与分析

5．4．1 不同花色苷样品对DPPH·的清除能力测定结果与分析

5．4．2 不同花色苷样品对ABTS+·的清除能力测定结果与分析

5．4．3 不同花色苷样品的总还原能力测定结果与分析

5．4．4 不同花色苷样品抑制脂质过氧化能力测定结果与分析

5．5 讨论

5．6 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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