毛果杨PtrMYB-like基因的功能研究

摘要

MYB转录因子广泛存在于所有的真核生物中，其家族成员数量庞大、功能多样化。在植物中，MYB家族进行了有选择地进化扩增，尤其以R2R3-MYB类型的成员数目最多。R2R3-MYB类型成员参与许多植物特有的生物学过程中，包括初生和次生代谢、细胞形态发生、组织器官发育、生物和非生物胁迫等。苯丙烷代谢是植物次生代谢的重要途径，从苯基丙氨酸产生的次级代谢物如单体木质醇、黄酮类化合物、酚酸等直接影响植物的生长发育。目前，许多研究集中在R2RR3-MYB类型成员调控某一种次级代谢物（如木质素或花青素）的合成途径，而对于植物中仅含有一个结构域的MYB-related蛋白的功能缺乏系统深入地研究。本研究从毛果杨中鉴定了一个PtrMYB-like基因，其在花青素和次生壁合成途径中扮演着双重角色。主要研究结果如下:
　　毛果杨PtrMYB-like基因Locus Name为Potri.015G069000，含有3个外显子和2个内含子，全长CDS序列包含954个核苷酸、编码318个氨基酸。同源性检索发现，在拟南芥、小麦、大豆等物种中都存在其同源基因。结构域分析显示，这些基因在进化上具有高度的保守性。
　　定量PCR结果显示，毛果杨PtrMYB-Bke基因表达在所有组织中，其中在木质部、形成层、韧皮部、幼叶、老叶和叶柄高丰度表达，在根和顶芽的转录表达水平比较低;PtrMYB-like基因在第1～4茎节的转录表达水平逐渐升高，在第5～10茎节均有不同程度的转录表达。
　　构建CaMV35S启动子驱动的PtrMYB-like融合绿色荧光蛋白GFP的融合载体，并转化拟南芥。通过观察转基因拟南芥根部的GFP荧光信号，发现PtrMYB-like蛋白定位于细胞核。
　　通过观察表型，发现转PtrMYB-like基因拟南芥的4d苗出现花青素积累表型，花青素生物合成途径中结构基因和调控基因的转录水平均不同程度地增强，说明Ptr MYB-like基因调控整个花青素合成途径。此外，转PtrMYB-like基因拟南芥的25d苗出现生长缓慢表型，其木质部纤维细胞呈不规则状态，且次生壁合成相关基因的转录水平不同程度地升高，说明PtrMYB-like基因参与拟南芥次生壁的生物合成。
　　同时，结合反向遗传学手段，在84K杨树(Populus alba x P.glandulosa)中下调PtrMYB-like基因，获得高效沉默该基因的转杨树遗传材料，为全面剖析PtrMYB-like基因在杨树中的功能奠定了材料基础。

目录

摘要

1 绪论

1．1 植物MYB转录因子的结构与分类

1．2 植物MYB转录因子的进化过程

1．3 MYB-related转录因子的分类及进化

1．4 植物花青素的生物合成途径

1．4．1 MYB转录因子调控花青素合成

1．4．2 MBW复合物调控花青素合成

1．5 MYB转录因子对植物次生生长的作用

1．5．1 转录因子调控次生壁合成网络

1．5．2 MYB转录激活因子参与次生壁合成

1．5．3 MYB转录抑制因子参与次生壁合成

1．6 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 植物材料

2．2 菌株及载体

2．3 主要试剂及培养基

2．4 实验仪器

2．5 实验方法

2．5．1 数据库搜索和序列分析

2．5．2 植物基因组DNA的提取

2．5．3 植物总RNA的提取

2．5．4 mRNA反转录合成cDNA

2．5．5 引物设计

2．5．6 载体构建

2．5．7 目的DNA片段胶回收

2．5．8 大肠杆菌转化

2．5．9 质粒提取

2．5．10 农杆菌感受态的转化

2．5．11 拟南芥转化

2．5．12 拟南芥种子的消毒和萌发

2．5．13 花青素含量的测定

2．5．14 84K杨树遗传转化

2．5．15 半定量RT-PCR

2．5．16 实时荧光定量PCR

2．5．17 植物组织石蜡包埋与切片

2．5．18 细胞壁组织化学染色

2．5．19 显微镜观察

3 结果与分析

3．1 毛果杨PtrMYB-like结构域分析

3．2 毛果杨PtrMYB-like组织表达特征

3．3 毛果杨PtrMYB-like基因在拟南芥中过量表达

3．4 毛果杨PtrMYB-like蛋白的亚细胞定位

3．5 毛果杨PtrMYB-like基因正调控拟南芥花青素的合成代谢

3．6 毛果杨PtrMYB-like基因正调控拟南芥次生壁的合成代谢

3．7 毛果杨PtrMYB-like-amiRNa转基因杨树的制备

4 讨论

4．1 毛果杨PtrMYB-like是一个1R-MYB蛋白

4．2 毛果杨PtrMYB-like蛋白定位于细胞核

4．3 毛果杨PtrMYB-like基因同时参与花青素和次生壁合成

4．4 毛果杨中可能存在与PtrMYB-like功能冗余的基因

5 结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明