Jumu在果蝇造血作用及细胞免疫中的功能研究

摘要

与脊椎动物相似，果蝇的造血作用在发育过程中也发生在两个阶段;第一类血细胞来自胚胎头部中胚层，第二阶段的造血发生在幼虫的淋巴腺中。淋巴腺是果蝇重要的造血器官，其前体血细胞的分化命运依赖于内部因子及微环境中细胞间的广泛相互作用。在变态发育开始时，淋巴腺会裂解并释放浆细胞及晶细胞到血淋巴中。果蝇缺乏获得性免疫只能依赖于天然免疫，如体液及细胞免疫来抵抗入侵的病原体。细胞免疫应答主要由浆细胞、晶细胞及薄层细胞参与。近年来果蝇的造血作用及天然免疫已被广泛研究且发现其调控机制与哺乳动物具有高度相似性，因此果蝇已逐渐成为研究血液及免疫相关疾病的良好模型。
　　之前的研究发现jumu缺失突变体成虫出现血细胞吞噬缺陷及较弱的抵抗病原体感染能力。此外Jumu在哺乳动物中的同源物Foxn1能调节小鼠胸腺上皮细胞的生长及分化，Foxn1敲除的小鼠表现出严重的免疫缺陷及T细胞发育的缺乏。根据上述结果进一步探究Jumu在果蝇造血及天然免疫中的调节机制可为深入理解Foxn1及其他FOX家族成员在哺乳动物造血作用及其相关疾病中的功能提供良好的理论基础。
　　本研究主要以jumu突变体及RNAi果蝇为研究材料，通过免疫荧光染色、原位杂交、实时荧光定量，染色质免疫共沉淀(ChIP)等实验方法对淋巴腺前体血细胞分化进行了研究。本研究结果表明Jumu通过多种调控机制调节淋巴腺血细胞的分化。Jumu通过细胞自主的方式调控MZ区Col的表达及非细胞自主的方式防止PSC细胞的异位产生来间接维持前体血细胞的正常分化。Jumu通过细胞自主的方式正调控PSC区dMyc的表达来控制PSC细胞的增殖，且ChIP及双荧光素酶报告基因结果表明Jumu通过与dmyc启动子上的FKH结合位点的结合调控其转录.此外，还发现jumu在整个淋巴腺的缺失可通过激活Toll信号通路来诱导薄层细胞的产生。
　　在本研究中还通过注射病原微生物，免疫荧光染色，实时荧光定量等实验方法进一步探讨了Jumu在幼虫游离血细胞发育及吞噬中的作用。本研究结果表明jumu的缺失可导致游离血细胞吞噬功能减弱并抑制丝状伪足的延展。Real-time PCR及免疫染色结果显示jumu缺失的血细胞中吞噬受体基因NimC1，Dscam，peste，draper及丝状伪足形成基因fascin的mRNA水平下调且NimC1，Ena，Fascin的蛋白水平也下调。jumu双杂合突变体及jumu RNAi果蝇的淋巴腺及游离血细胞中处于S期及M期的细胞比例明显增多，但jumu严重缺失的血细胞在有丝分裂过程中出现纺锤体形成及胞质分裂缺陷进而导致变大的多核细胞的产生。jumu在游离血细胞中的基因沉默导致CycA，png及piwi mRNA水平下调而CycB及CycD转录水平上调。此外，jumu的缺失还自发诱导了Toll信号通在游离血细胞及脂肪体中的激活。我们的研究结果为探讨细胞骨架调节蛋白在吞噬中的调控机制提供了新思路，同时为进一步分析Jumu同源物在哺乳动物天然免疫中的调控机制提供了理论基础。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 果蝇的造血作用

1．2．1 果蝇血细胞的谱系、产生及发育

1．2．2 胚胎造血作用的调控机制

1．2．3 淋巴腺造血作用的研究

1．3 果蝇的天然免疫

1．3．1 体液免疫应答

1．3．2 血细胞参与的免疫应答

1．3．3 由细胞因子介导的系统性免疫应答

1．4 jumu基因的研究进展

1．5 本研究的目的与意义

2 Jumu在果蝇淋巴腺造血系统中的功能研究

2．1 材料与方法

2．1．1 果蝇品系

2．1．2 仪器设备

2．1．3 免疫荧光染色

2．1．4 淋巴腺ROS染色

2．1．5 图像分析

2．1．6 Real-time PCR

2．1．7 原位杂交(In Situ Hybridization)

2．1．8 染色质免疫共沉淀(ChIP)

2．1．9 dmyc启动子序列报告载体的构建

2．1．10 Overlapping PCR定点突变

2．1．11 双荧光素酶报告基因检测

2．2 结果与分析

2．2．1 Jumu的缺失引起前体血细胞的异常分化

2．2．2 Jumu对Col+PSC细胞的增殖及异位扩散具有负调控作用

2．2．3 Jumu突变体淋巴腺中异位PSC细胞的来源鉴定

2．2．4 Jumu在淋巴腺前体细胞中的表达可防止PSC细胞异位迁移

2．2．5 Jumu对PSC区形态的调节不依赖于Slit/Robo信号通路

2．2．6 Mz区jumu的缺失能够非细胞自治的诱导PSC区dMyc的增加

2．2．7 Jumu通过细胞自治地调节MZ区Col的表达来控制前体血细胞分化

2．2．8 Jumu通过细胞自治的方式控制PSC区的大小

2．2．9 Jumu对PSC区细胞数量的调控不依赖于Col及Dpp信号通路

2．2．10 Jumu通过调控dMyc的表达来控制PSC细胞增殖

2．2．11 Jumu作为转录因子直接调控dmyc的转录

2．2．12 双荧光素酶报告基因检测Jumu在dmyc启动子区的结合位置

2．2．13 Jumu对PSC区发育的时空调控分析

2．2．14 Jumu在整个淋巴腺中的缺失可诱导薄层细胞的产生及TOll信号通路的激活

2．3 讨论

2．4 本章小结

3 Jumu在果蝇血细胞发育及细胞免疫中的功能研究

3．1 材料与方法

3．1．1 果蝇品系

3．1．2 主要仪器设备及试剂

3．1．3 游离血细胞计数

3．1．4 果蝇幼虫体内血细胞吞噬实验

3．1．5 免疫荧光染色

3．1．6 Phalloidin染色

3．1．7 BrdU染色

3．1．8 TUNEL染色

3．1．9 细胞转染及Western Blot分析

3．1．10 图像分析及定量

3．1．11 基因芯片分析差异表达基因

3．1．12 Real-time quantitative PCR

3．2 结果与分析

3．2．1 Jumu参与血细胞的吞噬及发育

3．2．2 Jumu通过调控NimC1的表达来影响血细胞的吞噬功能

3．2．3 jumu及NimC1表达的缺失导致丝状伪足的缺乏

3．2．4 Jumu调控丝状伪足形成相关基因的表达

3．2．5 jumu的过表达促进细胞延展及丝状伪足的形成

3．2．6 jumu过表达的血细胞基因表达谱分析

3．2．7 Jumu通过调控细胞周期及胞质分裂来维持血细胞正常的有丝分裂

3．2．8 Jumu通过调控血细胞中Toll信号通路的激活来诱导薄层细胞的产生

3．3 讨论

3．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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