果蝇行为学研究系统及研究方法

摘要

一种果蝇行为学研究系统，属于动物行为学领域。该系统包括如下装置：果蝇活动容器，为具有特异性蛋白的果蝇提供活动空间；影像采集装置，采集果蝇行为影像；刺激装置，对果蝇实施外界刺激；中心装置，与影像采集装置和刺激装置相连，控制影像采集装置及刺激装置并记录果蝇行为影像以及分析果蝇行为。此外还涉及果蝇行为学研究方法，包括步骤：对具有特异性蛋白的果蝇实施刺激；采集果蝇活动影像；根据果蝇活动影像分析果蝇的行为。上述系统在对果蝇行为学研究中对果蝇的刺激、行为的记录及分析都是自动进行的，可以免除人工观测统计因受经验或疲劳因素带来的偏差，且有针对性地对果蝇进行刺激，提高了分析果蝇行为分析的精度和效率。

说明书

【技术领域】

本发明涉及动物行为学领域，尤其涉及一种果蝇行为学研究系统及研究方法。

【背景技术】

动物行为学是研究动物和环境或其他生物的互动，是以其沟通行为、情绪表达、社交行为、学习行为、繁殖行为等为研究对象的学科。相对于微观研究，动物行为学能反映出多因素混合作用下的动物的整体状态。神经遗传学作为脑科学的重要组成部分，一方面在分子水平上研究基因如何调控脑结构的发育及功能；另一方面，行为作为脑的主要功能表现形式，通过研究不同的行为变化与脑的关系，可以最终了解基因如何编码遗传行为。

动物行为是由相应的神经元支配的，果蝇是神经遗传学研究的理想动物模型，果蝇之间的社会行为主要分为两类：求偶行为和攻击行为，都具有很强的遗传因素。

光感基因神经调控技术(Optogenetic Technology)可以调节特定细胞类型，用病毒载体将光敏感通道或泵蛋白基因导入某一特定的细胞亚群中表达，其中一种光敏感型通道蛋白(Channelrhodopsin-2，ChR2)对蓝光(473nm波长)敏感，蓝光可激活该通道，而使Na+、K+等阳离子进入细胞内而兴奋细胞，另一种氯离子蛋白(Halorhodopsin，NphR)对黄光(593nm波长)敏感，黄光将使Cl-进入细胞而抑制细胞，这样利用交替的蓝光或黄光就可以在特定细胞亚群水平上控制细胞活性。这项技术具有空间上的细胞特异性(应用特定启动子诱导相应基因在特定细胞群中表达)和时间上毫秒水平上的精确性。因此，利用该技术通过光在毫秒水平上调控某种特定细胞亚群的活性，可以实现特定神经通路水平上对动物行为的调控。

温度也会对果蝇的行为产生影响。如2002年11月德国自然科学月刊《Geo》报道了美国洛杉矶贝克曼研究所用一种叫“melanogaster”的雄性果蝇做实验。他们发现，如果实验室温度是19摄氏度，这些果蝇具有明显的异性恋行为。但当温度升高到30摄氏度以上，它们的行为数分钟内就会改变。此时，雄性果蝇会对雌性果蝇不屑一顾，而转为追逐它们的同性伙伴。不过一旦降低到原先的温度，这些果蝇的行为也回归正常。美国《科学》杂志上发表论文称京都大学教授梅田真乡领导的研究小组利用基因工程技术研究果蝇基因，发现果蝇体内一种名为“DmDG”的基因活性一旦下降，果蝇就会“怕热”，从而喜欢向温度更低的地方转移，其喜好的环境温度要比正常情况下低5摄氏度。推测“DmDG”基因可能与果蝇的代谢功能相关。这个基因活性下降后，果蝇体内能量代谢就会活跃，于是就会更喜欢低温环境。

对果蝇行为学的观测目前一般是对录像进行的人工观测统计，费时费力，并且受到经验或疲劳等因素的影响而产生较大偏差。

【发明内容】

有鉴于此，有必要提供一种自动刺激、记录及分析果蝇行为的系统。

一种果蝇行为学研究系统，包括如下装置：果蝇活动容器，为具有特异性蛋白的果蝇提供活动空间；影像采集装置，采集果蝇行为影像；刺激装置，对果蝇实施外界刺激；中心装置，与所述影像采集装置和刺激装置相连，控制影像采集装置及刺激装置并记录果蝇行为影像以及分析果蝇行为。

上述系统在对果蝇行为学的研究中对果蝇的刺激、行为的记录及分析都是自动进行的，可以免除人工观测统计因受经验或疲劳因素带来的偏差，且处理效率高。

优选地，所述果蝇活动容器为透明容器，包括顶盖、侧壁及底座，所述侧壁涂有氟隆材料和反光材料并设有气孔，所述顶盖滑动地设于侧壁上缘，所述侧壁与底座卡接。

优选地，所述影像采集装置设置于果蝇活动容器的上方，为拍摄速度大于200帧/秒的摄像机。

优选地，所述刺激装置包括光刺激装置和温度刺激装置，所述光刺激装置设于果蝇活动容器上方，所述温度刺激装置设于果蝇活动容器底座中。

优选地，所述光刺激装置为激光发生器或LED光源。

优选地，所述激光发生器包括波形发生器、激光器和激光发射端，所述波形发生器与中心装置连接，所述激光器连接波形发生器并通过光纤与激光发射端相连，所述激光发射端设于果蝇活动容器的上方。

优选地，所述LED光源包括白光LED、蓝光LED以及黄光LED，所述白光LED、蓝光LED以及黄光LED设于薄的银板上，所述银板对称地设于果蝇活动容器侧壁，且与设于底座中的单片机相连。

优选地，所述中心装置为搭载有数据分析平台的计算机，所述数据分析平台包括刺激参数控制模块、影像输入模块、检测跟踪模块、特征提取模块、行为甄别模块以及用户界面模块，所述刺激参数控制模块与刺激装置相连，所述影像输入模块连接影像采集装置，所述用户界面模块提供用户操作及观看果蝇影像的界面。

此外，还提供一种果蝇行为学研究方法

一种果蝇行为学研究方法，包括如下步骤：对果蝇实施刺激；采集果蝇活动影像；根据果蝇活动影像分析果蝇的行为。

有针对性地对果蝇进行刺激，然后对果蝇的行为进行自动采集、记录和分析，提高了分析果蝇行为分析的精度和效率。

优选地，对果蝇实施的刺激包括光刺激和温度刺激。

优选地，根据果蝇活动影像分析果蝇的行为包括如下步骤：根据果蝇活动影像检测果蝇轮廓，建立果蝇模型；根据果蝇模型及其运动信息提取用于分析果蝇活动的特征参数；设定果蝇行为的各特征参数的标准；根据实际提取的果蝇的各特征参数及所述标准确定果蝇的行为；统计果蝇各种行为发生的频率，分析行为与刺激的对应关系。

优选地，所述果蝇模型为三个部分重叠的椭圆，分别表示果蝇的躯干和左右翅膀，其中躯干椭圆的中心点与左翅膀椭圆和右翅膀椭圆的长轴端点交于一点，对应所述果蝇模型具有八个轨迹参数，分别为躯干椭圆中心点坐标、躯干椭圆长轴长度、躯干椭圆短轴长度、躯干椭圆长轴与横坐标的夹角、左翅膀椭圆长轴的长度、右翅膀椭圆长轴的长度、左翅膀椭圆长轴与躯干椭圆长轴的夹角以及右翅膀椭圆长轴与躯干椭圆长轴的夹角。

优选地，果蝇的行为包括求偶行为和攻击行为。

优选地，所述求偶行为包括展翅、回旋、交尾和求偶性追逐。

优选地，所述攻击行为包括前扑、撕斗、威胁和攻击性追逐。

优选地，确定果蝇行为的步骤包括阈值法预处理的步骤和监督学习分类的步骤，所述阈值法预处理具体为，将所获得的果蝇的特征参数与预设的阈值进行比较，初步判定果蝇行为的类型；所述监督学习分类具体为，根据模式识别方法修正判定的结果，最终确定果蝇的行为类型。

【附图说明】

图1为为果蝇行为学系统示意图；

图2为实施例1的果蝇行为学研究系统结构图；

图3为果蝇模型图；

图4为实施例2的果蝇行为学研究系统结构图；

【具体实施方式】

果蝇行为由相应脑区或神经节的神经细胞所调控，具体来说例如调节果蝇学习记忆的多巴胺能和章鱼胺能(octopaminergic，OCT)神经元，前者还能调控运动控制，后者能调控侵略行为(aggression)等重要的脑高级功能。它们广泛分布于果蝇脑的高级控制中心蘑菇体和中央复合体，将带有多巴胺或章鱼胺神经元特异启动子的光敏基因ChR2/NpHR载体打入上述脑区，通过病毒转染使这些神经元变成对光敏感的细胞，通过蓝光或黄光对其进行刺激，即可引起该类细胞兴奋或抑制，从而调控果蝇的行为。

采用果蝇行为学研究系统有针对性的对果蝇行为进行调控并且分析，可以很好的进行果蝇行为学研究。如图1所示，为果蝇行为学研究系统示意图。果蝇行为学系统包括果蝇活动容器、影像采集装置、刺激装置以及中心装置。影像采集装置和刺激装置均与中心装置相连。该果蝇活动容器为透明容器，为具有特异性蛋白的果蝇提供活动空间且可从外部采集果蝇行为影像；刺激装置对果蝇实施外界刺激，激发其特异蛋白表达，引发果蝇特定行为；中心装置记录果蝇行为影像以及分析果蝇行为，控制影像采集装置及刺激装置。

实施例1

如图2所示，为本实施例的果蝇行为学研究系统结构图。本实施例的果蝇活动容器包括两个果蝇活动室100，刺激装置包括光刺激装置210和温度刺激装置220、影像采集装置为摄像机300，中心装置采用计算机400。光刺激装置210和摄像机300设于果蝇活动室100的上方，温度刺激装置220设于果蝇活动室100的底部。光刺激装置210和摄像机300均与计算机400相连。

果蝇活动室100不限于两个，可以多于两个，便于同时进行多种不同实验，多个果蝇活动室100用不透光材料制成的夹层140隔开。果蝇活动室100截面形状为圆形或多边形，包括顶盖110、侧壁120及底座130，顶盖110用透光性较强的材料制成且滑动地设于侧壁120上缘，便于放入果蝇。侧壁120涂有氟隆材料和反光材料并设有气孔，侧壁120与底座130卡接。底座130中央放有食物块150，为果蝇提供食物。

光刺激装置210为激光发生器，包括与计算机400连接的波形发生器213、激光器212、激光发射端211。激光器212与波形发生器213相连，并由光纤连接到激光发射端211。激光器212为473/593nm即蓝/黄光激光器，可以发射蓝光和黄光。激光发射端211数量与果蝇活动室100的数量相同，且对应地设于果蝇活动室100的上方为果蝇提供光刺激。波形发生器213用于调节激光器212的各参数，如光的种类(蓝光、黄光或混合光)、强度、频率、波宽、脉宽及单波个数等。

温度刺激装置220为数显气温调节器221，置于果蝇活动室100底部，与果蝇活动室100的数量相同。用于调节果蝇活动室100的环境温度，该气温调节器的调节精度高于0.1℃。

摄像机300用于采集果蝇活动的影像并传输给计算机400，为保证记录过程中的准确度以及避免采集过程中的模糊，本实施例中摄像机300优选为拍摄速度在每秒200帧以上的摄像机。

计算机400搭载有数据分析平台，该数据分析平台包括刺激参数控制模块、影像输入模块、检测跟踪模块、特征提取模块、行为甄别模块以及用户界面模块。

刺激参数控制模块，用于调控光刺激的参数，即光的种类(蓝光、黄光或混合光)、强度、频率、波宽、脉宽及单波个数等。

影像输入模块，将摄像机300拍摄的影像转为该数据分析平台可识别的视频数据格式，一般为大多数主流的视频格式，为优化实时运算的速度，该影像输入模块的内存堆栈中允许暂存100帧图像。

检测跟踪模块，检测果蝇的轮廓，包括身体轮廓和翅膀轮廓，建立果蝇模型，即近似为3个相交的椭圆，进而以此为基础检测果蝇行动轨迹。

特征提取模块，提取果蝇行为的特征参数。

行为甄别模块，通过检测到的特征参数与预设的参考模板确定果蝇行为。

用户界面模块，提供用户观看、操作及分析的可视界面。主要包括：

1.摄像头实时监控界面：实时观看摄像头记录的果蝇活动，或调取之前保存的视频数据重复观看；

2.实验环境参数调节：调节摄像头的角度和拍摄分辨率，镜头的缩放以及光源的角度和强弱；

3.行为自动记录参数调节：视频数据的采样率、不同类型行为特征参数的选取和阈值的设置，研究人员也可以自定义新的特征参数和录入新的正确参考模板；

4.自动记录结果统计分析：统计不同类型行为发生的次数、时间，对不同实验干预因素下的统计结果进行各种统计学分析；

5.结果的保存和输出：统计学分析结果的可视化、结果的保存、输出和打印。

根据上述的果蝇行为学研究系统研究果蝇行为的步骤如下：

S100：对具有特异性蛋白的果蝇实施刺激。本实施例中，特异性蛋白是指对蓝光(473nm波长)敏感的通道蛋白(Channelrhodopsin-2，ChR2)和对黄光(593nm波长)敏感的氯离子蛋白(Halorhodopsin，NphR)。蓝光可激活通道蛋白，而使Na⁺、K⁺等阳离子进入细胞内而兴奋细胞；黄光将使Cl^-进入细胞而抑制细胞，通过光在毫秒水平上调控某种特定细胞亚群的活性，可以实现特定神经通路水平上对动物行为的调控。

对果蝇的刺激包括光刺激和温度刺激。光刺激包括蓝光刺激、黄光刺激以及蓝光与黄光的混合光刺激。光刺激由激光发生器提供，温度刺激由气温调节器提供，其中激光发生器与计算机400连接，通过计算机控制波形发生器213可以调节光刺激的各参数，即上述的光的种类(蓝光、黄光或混合光)、强度、频率、波宽、脉宽及单波个数等，为果蝇行为学的研究提供多种不同的光刺激。同样

S200：采集果蝇活动影像。摄像机300用于采集果蝇活动影像，即拍摄果蝇活动的视频，拍摄的视频经过计算机400的图像采集卡输入计算机400。通过拍摄速度在每秒200帧以上的摄像机300的拍摄，视频在计算机400上显示的分辨率在100万像素以上，可以达到很好的观察及分析效果。

S300：根据果蝇活动影像分析果蝇的行为。果蝇的行为主要包括求偶行为和攻击行为，每种行为都是一个复杂的过程，可以包括多种类型的行为活动，对于果蝇行为的研究可以归纳为几种更为具体并有代表性的行为。

其中求偶行为包括：

1)展翅：雄性果蝇高速侧向扇动翅膀(频率可达280Hz)；

2)回旋：雄性果蝇以雌性为一个近似固定的中心做不规则的圆周运动；

3)交尾：雄性果蝇接近进而伏在雌性上方完成交尾，结束后即分开；

4)求偶性追逐：追逐果蝇跟随被追逐果蝇的行进轨迹运动，二者的距离较为接近但并不为零。

攻击行为包括：

1)前扑：一只果蝇快速抬起后足猛然向前扑住另一只果蝇；

2)撕斗：两只果蝇面对面，前足互相抓住对方；

3)威胁：果蝇的翅膀向侧面展开近80度，同时水平抬高40度左右，用来威胁对方；

4)攻击性追逐：与求偶性追逐类似，追逐果蝇跟随被追逐果蝇的行进轨迹运动，二者的距离较为接近但并不为零。区分二者的标志可以参考果蝇的后续行为是交尾还是撕斗。

对果蝇行为的分析主要由上述的检测跟踪模块、特征提取模块、行为甄别模块共同配合完成。

检测跟踪模块记录物体运动的轨迹参数，轨迹参数记录的视频采样率为每秒20帧，对当前采样时刻t的一帧采样图像：首先将24位真彩色图像转换为8位彩色像素图像，利用背景减除算法(background subtraction)对感兴趣物体(果蝇)进行图像分割和自动检测，采用轮廓截取术得到果蝇身体和一对翅膀的轮廓。果蝇的轮廓在系统坐标系中近似为3个相交的椭圆，分别表示果蝇的躯干和左右翅膀，其中躯干椭圆的中心点与左翅膀椭圆和右翅膀椭圆的长轴端点交于一点如图3所示，可标定躯干椭圆中心点坐标1、躯干椭圆长轴长度2、躯干椭圆短轴长度3、躯干椭圆长轴与横坐标的夹角4、左翅膀椭圆长轴的长度5、右翅膀椭圆长轴的长度6、左翅膀椭圆长轴与躯干椭圆长轴的夹角7以及右翅膀椭圆长轴与躯干椭圆长轴的夹角8。当果蝇开始运动时，本实施例采用自动的图像跟踪算法对果蝇的位置和朝向进行跟踪，包括利用均值平移算法(mean shift)跟踪局部邻域的直方图信息，以及卡尔曼滤镜(kalman filter)对果蝇未来的位置进行预测和修正。

轨迹参数记录开始，首先对摄像头视野内的所有果蝇进行编号：对某一只编号为k的果蝇，从当前一帧中记录到8个轨迹参数，示于下表：

  X_pos  果蝇躯干椭圆轮廓的中心原点横坐标  Y_pos  果蝇躯干椭圆轮廓的中心原点纵坐标  Maj_axis  果蝇躯干椭圆轮廓长轴长度  Min_axis  果蝇躯干椭圆轮廓短轴长度  Ang  果蝇躯干椭圆轮廓旋转的角度  Maj_wing_L  果蝇左侧翅膀椭圆轮廓长轴长度  Maj_wing_R  果蝇右侧翅膀椭圆轮廓长轴长度  Ang_wing_L  果蝇左侧翅膀椭圆轮廓旋转角度  Ang_wing_R  果蝇右侧翅膀椭圆轮廓旋转角度

特征提取模块从连续获得的轨迹参数中提取果蝇行为特征参数共25个，示于下表：

上述25个特征参数有些可从八个轨迹参数中直接获得，如果蝇位置、头部角度等；有些需要进行计算获得，如头部角度的改变δ_θ，就需要通过t时刻的Ang与t-1时刻的Ang相减得到。

果蝇的各种行为可以用上表中特征参数组合来进行识别。

识别果蝇行为主要由行为甄别模块完成，行为甄别模块包括阈值法预处理和监督学习分类两个部分。其中：

阈值法处理是指，根据经验设定各行为涉及的特征参数及参数阈值的标准，不同的行为所选的特征参数和阈值范围不同。当在某一特征时间采样点t，对某一行为涉及的各特征参数的值符合对该行为所设的特征阈值选取范围时，则认为果蝇进行了一次可能的该类型行为。具体如下：

①展翅：该行为的特征主要表现为雄性果蝇在身体保持水平的情况下(垂直观测角度上果蝇身体长度不变)，果蝇的翅膀做侧向高速扇动，扇动角度至少在60°以上。这一行为应至少持续1s以上。特征提取的方法为：当以下特征参数，以及附加参数P都满足时，则系统在t时刻记录到果蝇间的一次可能的展翅行为。

②回旋：该行为的特征主要表现为雄性果蝇以雌性为一个近似固定的中心做不规则的圆周运动。这一行为因至少持续0.7s以上。特征提取的方法为：当以下特征参数(其中V和V_az为合成速度和角速度，由速度分量V_x、V_y得到)，以及附加参数P都满足时，则系统在t时刻记录到果蝇间的一次可能的回旋行为。

③交尾：该行为的特征主要表现为交尾过程中雄雌果蝇的身体近似重合，交尾过程一般要持续一段时间。特征提取的方法为：取长度为8.3s的时间窗，如果在这一段时间内雄雌果蝇中心距离的均值和标准差小于阈值，则认为雄雌果蝇在这段时间内可能完成交尾行为。

④追逐：该行为的特征主要表现为追逐果蝇跟随被追逐果蝇轨迹进行的相对运动，两只果蝇间距离接近但并不为零。要保证果蝇运动的方向相同，果蝇头部夹角不能超过45°；为保持追逐的状态，果蝇运动速度和方向基本一致，果蝇间的距离不能超过10mm，但又不能近似重合，否则可能转入交尾或撕斗行为；追逐时间因持续1s以上。特征提取的方法为：当以下特征参数，以及附加参数P都满足时，则系统在t时刻记录到果蝇间的一次可能的追逐行为。

⑤前扑：前扑行为特征相对比较复杂，假设在t时刻发生前扑行为，可以认为从t-2到t-1时间内，攻击方果蝇首先身体抬起，则从垂直视角观测果蝇的身体长度缩短；而到t时刻前扑发生时，身体长度基本复原。t-1到t时间内攻击方果蝇前冲发起攻击，具有较大的速度和加速度，两只果蝇中心距离缩短；被攻击方果蝇应该处于不备或者摆脱追逐的状态，因此两果蝇头部夹角因小于45°。特征提取的方法为：在以下特征参数都满足时(其中a合成加速度，由速度分量a_x、a_y得到)，则系统在t时刻记录到果蝇间的一次可能的追逐行为。

⑥撕斗：该行为的特征主要表现为两只果蝇距离很小，头部相对，同时具有很高的速度和加速度。撕斗时间至少持续0.3s以上。特征提取的方法为：在以下特征参数，以及附加参数P都满足时，则系统在t时刻记录到果蝇间的一次可能的撕斗行为。

⑦威胁：该行为的特征主要表现为攻击方果蝇翅膀角度的变化，同时向攻击目标缓慢的移动。威胁行为至少持续0.3s以上。特征提取的方法为：在以下特征参数，以及附加参数P都满足时，则系统在t时刻记录到果蝇间的一次可能的威胁行为。

由于阈值法预处理中设定的的限定条件较宽，直接作为判别依据产生的分类结果误差较大。因此采用监督学习分类的模式识别方法修正判别结果，提高行为分类准确度。以前扑行为为例作如下说明：

1.对一段连续拍摄记录的果蝇行为影像时间，由专家对其认为属于前扑动作的行为进行手工标定。为减少手工选取对专家经验的依赖，可由两名以上专家独立完成标定，并使用投票原则降低经验误差风险。设经过标定得到了P个前仆行为的样本，对这些样本提取其与前仆行为有关的行为特征参数，将参数的值构成一个行为特征向量X_P，由所有已标定的行为样本的行为特征向量构成了前仆行为的训练集合{X_p∈C₁，p＝1，...，P}，C₁代表类别；2.同时由专家随机标定相同个数属于非前扑行为的样本，构成非前扑行为的训练集合{X_p∈C₂，p＝1，...，P}。

3.两类训练集合样本数应控制在200以上，用两类训练集合训练一个线性判别函数(LDA)分类器。在训练完成后，当后续未知的样本首先经过预处理，被判别为可能的前扑行为后，该样本的前仆行为特征向量将被输入到LDA线性分类器中进行识别，最终得到监督学习下的，更加准确的前扑行为判别结果。其它行为的最终判别过程相同。

实施例2

上述实施例中，提供光刺激的装置为激光发生器，并由计算机400通过数据线与波形发生器213连接，控制激光的参数。

还可以利用其他的装置提供光刺激，如本实施例中的LED光源。

如图4所示，为本实施例的果蝇行为学研究系统示意图。在果蝇活动室100的侧壁120内对称地设有薄的银板231，数量为4条、8条或更多。每条银板231上周期性地依次设有白光LED232、蓝光LED233以及黄光LED234。每种LED的数量可以调节，如白光LED232、蓝光LED233、黄光LED234的数量分别为2个、3个、4个。LED的光强度要足够大，优选为80lm(流明)以上。所有的LED通过银板231上的电路与单片机235相连，单片机235通过其中的通用异步接收/发送装置(UART)与USB接口信号转换芯片236相连，该USB接口信号转换芯片示例为FT232RL。然后通过USB连接到计算机400，通过数据分析平台中的刺激参数控制模块控制单片机235调节LED的发光参数。

与实施例1相比，本实施例具有装置简单，成本低的特点。

在其他的实施例中，还可以在果蝇活动室100的上部设置照明灯提供照明，为防止照明光对摄像机300的影响，照明灯上部设有遮光板。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。