小电导-Ca2+-激活K+通道在小鼠房室结细胞的表达及其功能的研究

摘要

研究背景及目的： 房室结(atrioventricular node，AVN)是位于右心房和心室之间高度特化的传导组织，是唯一连接心房和心室之间的传导通道，也是兴奋由心房进入心室的唯一电信号通道。它的重要功能是保证心房和心室在不同的时间内有序的收缩。房室结的传导速度很慢，其中，以结区的传导速度为最慢。这一慢的传导将导致心房和心室之间的收缩延迟，以保证心室不会与心房发生同步收缩。在某些病理情况下，房室结具有进一步的功能，例如，窦房结起搏点或心房传导障碍，房室结将以它固有的自律性成为心室工作的起搏点。 尽管，已知房室结的重要功能和意义，但对其电生理机理仍不明确。已有研究表明某些离子通道及离子通道基因表达在心肌细胞，包括自律细胞，例如，心脏起搏组织窦房结和房室结存在小电导-Ca<'2+>-激活K<'+>通道(small-conductance calcium-activated potassium channel，SK channel)。SK通道是K<'+>选择性，非电压依赖性，唯一通过细胞内Ca<'2+>激活的一种钾通道。在哺乳动物脑内，SK通道主要有3种亚型：SK1、SK2和SK3通道，它们对蜂毒明肽(apnmin)-SK通道的阻断剂的敏感性不同，其中，SK2通道对apamin最敏感，其次是SK3通道，SK1对apamin的敏感性较低。迄今为止,已编码至少3个明确的SK通道基因，即KCNN1(SK1)、KCNN2(SK2)和KCNN3(SK3)。 SK通道广泛存在于机体不同的组织，包括脑、周围神经、肝脏和平滑肌。SK通道在心脏表达的功能意义，鲜为人知。Dr.Chimnvimonvat实验室近来证明人和小鼠心肌细胞存在SK2通道，明显参与动作电位的复极化过程，且在心房的表达明显高于心室。进一步研究发现，过表达SK2通道的小鼠易发生心律失常，并伴有明显的房室结功能及房.室传导异常。本研究采用SK2通道过表达小鼠和SK2通道敲除小鼠，分别检测了它们对房室结功能的影响，首次证明了SK2通道在房室结的重要功能意义。通过建立HEK(Human embryonic kidney)293细胞SK2通道表达细胞株，探讨了SK2通道的调节及其与a-actinin2(肌动蛋白细胞骨架的结合蛋白)相互作用的分子机理。 方法： 1.本研究采用16-22 W，体重20-25g,具有C57B1/6J背景的SK2通道过表达小鼠(SK2+/T)，SK2通道敲除小鼠(SK2+/Δ，SK2Δ/Δ)及SK2野生型小鼠(Wild-type，WT)，雌雄不拒。 2.动物心电图(Electroc,ardiogram，ECG)记录：上述3组动物，腹腔注射苯巴比妥钠麻醉(60mg/kg)，37℃条件下行肢体导联记录。 3.AVN自发性动作电位(action potential，AP)记录：动物麻醉同上，取出心脏，暴露右心房，分离房室结区。采用3 mol/L KCI微电极细胞内记录SK2+/T、SK2+/Δ及WT组房室结自发性AP。 4.AVN细胞分离及全细胞IK,ca的记录：WT、SK2+/T and SK2+/Δ小鼠AVN单个细胞的分离参照以往的方法并进行改良。单个AVN细胞Ca<'2+>激活K<'+>电流(Cd<'2+>.activited K<'+>current，IK ca)的记录采用全细胞膜片钳法，钳制电压为-55mV，给予阶梯去极化脉冲刺激从-90mV～+40mV，滤波2 KHz，采样频率10 KHz。记录给予apamin(500 pmol/L)前后的lgca，室温下进行。Apamin-敏感K<'+>电流的计算为apamin(500 pmol/L)给药前后Ik,ca电流密度的差(值)。 5.双重免疫组化荧光标记：取WT和SK2Δ/Δ小鼠新鲜分离的心肌细胞，4％多聚甲醛固定，1％牛血清白蛋白封闭，加入一抗，4℃过夜。双重免疫组化荧光标记分为2组①抗SIC7.抗体(1：100稀释)+α-actinin2抗体(1：800)；②抗SK2抗体(1：100)+抗NF 160KD(neurofilament 160 KD，NFl60 KO)抗体(1：100)。二抗为FITC-羊抗兔IgG(1：250)和TEXRED-羊抗鼠IgG(1：250)。以二抗作为阴性对照，同时进行。 6.免疫组织化学：制备WT及SK2基因敲除小鼠(SK2△/△)心脏石蜡系列切片.各取WT及SK2△/△相邻心脏切片，5％羊血清封闭，抗SK2抗体(1：200)与切片孵育，4℃过夜，再与生物素标记的二抗反应。 7.建立SK2通道表达的HEK293细胞株：HEK293细胞株在Dulbecco's modified Eagle's培养液常规条件下培养并传代(37℃ in an air/5％CO2)。参照 Lipofectamine<'TM>2000试剂盒说明书，下列质粒分别转染入HEK293细胞：1) pSK2-IRES-EGFP&pcDNA3-α-actinin2：2)pSK2-IRES-EGFP。 8.膜片钳记录：转染后36～48 hrs的HEK293细胞在室温条件下行全细胞膜片钳Ikca记录。记录前4hrs，将已转染SK2+和α-actinin2质粒的细胞给予Cytochalasin D(CyD，2.5μmol/L)。IK,ca记录程序和条件同上述AVN细胞。 9.HEK293细胞SK2和a-actinin2蛋白的表达：Western blot检测共转染α- actinin2和SK2的HEK293细胞α-actinin2和SK2蛋白的表达。 10.免疫组化荧光标记：将共转染SK2+α-actinin2质粒后2-3 day的细胞2％多聚甲醛固定，1％牛血清白蛋白封闭，加入抗SK2抗体(1：100)+抗α-actinira.抗体(1：800)，0C过夜。二抗为FITC-羊抗兔IgG(1：250)和TEXRED-羊抗鼠IgG(1：250)。 结果 1.SK2+/T和SK2+/△小鼠显示窦房结和AVN功能异常：心电图的记录表明SK2+/△小鼠与wT比较，P-R间期明显延长，并伴有窦性心动过缓。相反，SK2+/Tr小鼠R-R问期及P-R间期明显缩短。提示过表达SK2基因和SK2基因敲除小鼠存在窦房结和房室结起搏功能和房.室传导功能的明显异常。 2.SK2+/T小鼠AVN着火率增加，相反的结果见SK2+/△小鼠：分离的AVN自发性AP具有慢的4期自动去极化，且除极速率慢，无明显超射。这些特征表明其自发性AP来自AVN。与WT比较，SK2+/T组AvN自发性AP的频率增加。而SK2+/△小鼠AVN着火频率明显减小。详细分析自发性AP发现其周期长度(cycle-length，CL)、动作电位持续时间(action potential duration，APD)及舒张期自动去极化速度(the rate of diastolic depolarization，DDR)有明显变化。与WT比较，过表达SK2通道引起AP复极达80％(APD80)的时间缩短，DDR增快及相应的CL缩短。相反的结果见于SK2通道缺失小鼠。结果表明，SK2通道表达异常可明显影响AVN细胞自发性着火频率，进而影响心脏房- 室传导。 3．单个AVN细胞IK,ca的变化：电流密度．电压关系曲线证明这一电流具有内向整流的特征，通道电流的大小随电压升高而减低，亦与时间无关，其电流的外向及内向成份都可被apamin所阻断。反转电位约-80 mV，符合Nernst方程。 SK2+/T小鼠，其AVN细胞appamin敏感K<'+>电流明显大于WT；而SK2通道敲除小鼠，其apamin敏感K<'+>电流明显小于WT。结果表明房室结细胞存在apamin敏感的IK,ca。推测其IK,ca的变化是AVN细胞自发性AP改变的直接原因。 4．激光共聚焦显微镜：单个AVN细胞具有对特异性SK2抗体的免疫阳性反应。心房和心室细胞也具有SK2蛋白的阳性信号。NF160作为心脏起搏组织和传导系统的标志，其阳性反应仅见于AVN细胞，以区别心室或心房细胞。 5．AVN SK2免疫阳性反应：心脏组织切片AVN，心房及室间隔均可见SK2蛋白阳性反应(棕色)。与WT比较，无明显阳性反应呈现于SK2△/△小鼠心肌组织，包括AVN。结果表明SK2免疫阳性反应存在于房室结。采用H&E和Tfichrome染色进一步鉴定了AVN的解剖部位。 6．A-actinin2对HEK293细胞IK,ca的调节：共表达a-actinin2和SK2细胞的IK,ca电流密度明显大于仅表达SK2细胞的电流密度，IK,ca电流密度增加了4倍。未转染的细胞，无明显IK,ca电流。Cytochalasin D预处理共表达α-actinin2和SK2通道的细胞，以阻断细胞骨架蛋白与SK2通道的相互作用，IK,ca电流密度明显减小。 7．SK2通道的表达及其与a-actinin2的共定位：Western blot检测共表达a-actinin2和SK2的HEK293细胞，其a-actinin2分子量约98 kDa。SK2蛋白表达为单聚体和二聚体，两个带分别约为60 and 120 kDa。结果与期望值一致。

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引言

第一部分SK2通道在小鼠房室结细胞的功能性作用

1.前言

2.材料和方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

第二部分α-actinin2对SK2通道的功能性调节

1.前言

2.实验材料和方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

综述：小电导-Ca2+-激活K+通道

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