真菌性角膜病常见致病菌种检测基因芯片的研究

摘要

真菌性角膜病是一种严重的致盲眼病，快速、敏感、高效地检测致病菌是防治该病和有效降低致盲率的重要前提。长期以来，对真菌性角膜病致病菌的实验室检测，一直采用直接涂片和分离培养等传统方法。由于这些方法有的敏感性、准确性较低，有的繁琐费时，难以达到快速、准确诊断的目的，因此对于临床而言，建立一种快速、敏感、特异性强的角膜致病真菌检测方法显得十分必要。本研究旨在利用基因芯片技术，结合通用引物进行真菌DNA的PCR扩增，与固定在芯片上的菌种特异性探针杂交，建立可同时检测多种致病菌，快速、敏感、特异性强的真菌性角膜病常见致病菌种检测体系。 在本研究中针对通用引物和特异性探针的设计、玻片芯片和尼龙膜芯片的制备以及临床应用等情况进行了实验，主要方法和结果概括如下： 一、异硫氰酸胍法提取12种标准真菌DNA，合成通用引物扩增12种标准真菌DNA，反应体系30μl，各成份为：20×buffer1.5μ1，MgCl<,2> 2.0mM，dNTP200μM，TaqDNA聚合酶2U，引物F1 8pmol，引物F2 8pmol，模板3μl，ddH<,2>O加至30μl。循环参数为：94℃预变性5min，94℃变性45sec，55℃退火60sec，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃再延伸5min。12种标准真菌应用通用引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳均显示清晰明亮的条带，未见非特异性扩增及引物二聚体的生成，与标准DNA Marker对照，位置约在550-650bp。建立了一种通用引物PCR扩增真菌DNA的优化技术体系。 二、用人基因组DNA，单疱病毒Ⅰ型和Ⅱ型、沙眼衣原体、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌DNA检测PCR特异性，相同PCR扩增条件下，同时对人基因组DNA，单疱病毒Ⅰ型和Ⅱ型、沙眼衣原体、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌DNA进行扩增，琼脂糖凝胶电泳未发现有扩增条带，证实该：PCR体系具有较高的特异性。倍比稀释法检测PCR的灵敏度，当DNA质量浓度为lOfg时，12种真菌DNA扩增产物均有阳性电泳条带产生，PCR扩增体系的整体灵敏度为10fg，提示该PCR体系具有较高的敏感性。 三、采用醛基化玻片制作基因芯片，对玻片处理方法进行优化。设计并合成12条探针，分别针对腐皮镰孢菌、串珠镰孢菌、梨状镰孢菌、尖孢镰孢菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、土曲霉菌、牵连青霉菌、新月弯孢菌、链格孢霉菌、白色念珠菌，探针3’端氨基化修饰后，点样于芯片上。选择最优化的杂交条件，分别用标准菌株的PCR扩增产物与基因芯片进行反向杂交。经优化实验选定最适杂交温度为42℃，杂交时间为1h，洗脱时间为1min。12种真菌标准菌株PCR产物与芯片杂交，均在各自相应的区域显示特异性的荧光信号。建立了一种荧光标记的基因芯片检测真菌性角膜病常见致病菌种的技术方法和优化的杂交反应体系。 四、将腐皮镰孢菌、烟曲霉菌、牵连青霉菌、新月弯孢菌标准菌株DNA的PCR扩增产物分别组合后与基因芯片杂交，并将人基因组DNA、单疱病毒Ⅰ型和Ⅱ型DNA、沙眼衣原体、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌DNA，经通用引物PCR扩增后，将反应混合物与芯片杂交，对芯片的特异性进行检测。将腐皮镰孢菌、烟曲霉菌、牵连青霉菌、新月弯孢菌标准菌株DNA的PCR扩增产物分别组合后与基因芯片杂交，均显示各自典型的荧光信号，无交叉反应发生。其他DNA扩增产物与芯片杂交无阳性信号产生，显示芯片具有较好的特异性。 五、采用倍比稀释法检测芯片杂交体系的灵敏度。12种真菌标准菌株检出的DNA质量浓度量为1Pg时所有菌株均有荧光信号显示，0.1pg时黑曲霉菌、土曲霉菌、牵连青霉菌和新月弯孢菌无荧光信号显示，故芯片的检测灵敏度为1pg。腐皮镰孢菌和烟曲霉菌PCR扩增产物稀释10倍时琼脂糖凝胶电泳无阳性条带显示，杂交后的基因芯片相应位置仍有荧光信号显示。 六、将各批次制备的芯片分别与腐皮镰孢菌PCR扩增产物杂交，检测芯片的变异系数，评价重复性。原子力显微镜扫描对醛基化玻片表面形貌进行分析。将不同保存时间的芯片进行杂交，观察其保存时效。各批次芯片的变异系数较小，重复性好。原子力显微镜对玻片不同处理阶段表面形貌的扫描说明醛基化玻片的化学变化。芯片制备完毕后，在常温下保存，2个月内使用，杂交信号强度没有明显的变化。本研究制备的醛基化芯片能够快速、敏感地进行真菌性角膜病常见致病菌种检测。 七、将寡核苷酸探针进行polydT加尾，与尼龙膜上的氨基共价结合，制备尼龙膜芯片。应用生物素标记的通用引物对12种真菌标准菌株DNA进行PCR扩增，产物与尼龙膜芯片杂交。用BCIP-NBT系统显色，观察杂交结果。12种真菌标准菌株DNA经PCR扩增，与尼龙膜芯片杂交，在各自特异性位置显色。建立了目视化尼龙膜芯片检测真菌性角膜病常见致病菌种的技术方法。根据反向斑点杂交原理，采用寡核苷酸探针加尾后点样制备尼龙膜芯片，利用生物素显色，能够准确鉴定12种真菌性角膜病常见致病菌，相对操作简便，实验成本低廉，具有临床推广应用价值。 八、采用玻片和尼龙膜芯片与82株临床分离株PCR产物杂交，采用玻片和尼龙膜芯片与170例临床标本PCR产物杂交，将玻片和尼龙膜芯片检测结果分别与KOH湿片法和分离培养法检测结果比较。82株临床分离株中，玻片芯片检测73株阳性，尼龙膜芯片检测69株阳性，两者之间无显著性差异。170例临床标本中，玻片芯片检测147例阳性，尼龙膜芯片检测143例阳性，真菌培养153例阳性，KOH湿片法113例阳性。两种芯片检测结果之间无显著性差异，它们与真菌培养结果之间无显著性差异，表现出良好的一致性，明显优于KOH湿片法。基因芯片检测真菌性角膜病常见致病菌种的灵敏度，显著高于KOH湿片法，与真菌培养结果无显著性差异。基因芯片对临床标本进行检测，并与KOH湿片法和分离培养法进行对比，验证了芯片的灵敏度及特异性，初步评价其临床应用价值，为将来临床检验中的广泛应用打下基础。 本研究证实，应用基因芯片技术进行真菌性角膜病致病菌种检测是完全可行的，具有比较理想的特异性、准确性和敏感性。能够通过PCR扩增和基因芯片杂交，在3-4h内完成对临床上常见的12种角膜致病真菌的菌种检测鉴定，操作简便、经济实用具有较广阔的临床应用前景。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

1.1研究背景

1.2立题思路和研究内容

第二章基因芯片引物设计和PCR扩增

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

2.5结论

第三章醛基化芯片制备工艺条件的确定

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果

3.4讨论

3.5结论

第四章醛基化检测芯片制备和杂交体系的优化

4.1引言

4.2材料与方法

4.3结果

4.4讨论

4.5结论

第五章醛基化检测芯片技术的实验室评价

5.1引言

5.2材料与方法

5.3结果

5.4讨论

5.5结论

第六章目视化尼龙膜芯片检测技术的建立

6.1引言

6.2材料与方法

6.3结果

6.4讨论

6.5结论

第七章真菌性角膜病常见致病菌种检测芯片的临床应用

7.1引言

7.2材料与方法

7.3结果

7.4讨论

7.5结论

第八章全文总结

参考文献

附录

文献综述

第一部分真菌性角膜病的病原学诊断

第二部分基因芯片技术概况及其在病原微生物检测中的应用

在读期间科研情况

致谢