猪的六种常见致病菌基因芯片检测技术的研究

摘要

细菌病在我国不同规模的养猪场常年不断发生，特别是病毒病在猪群中流行时，细菌病往往都会出现，出现混合感染或继发感染，致使猪群的发病率和死亡率都有很大程度提高，给我国的养猪业造成巨大的经济损失。当前，免疫抑制性疾病在猪群中普遍存在，致病菌新的血清型不断出现，抗生素滥用造成细菌耐药性不断提高，甚至出现超级细菌，而且猪场和社会的生物安全措施不健全、不到位，这些不利的情况给我国猪病的治疗和防控工作带来很大的困难。通过对规模化养猪场送检的病料进行细菌学分离鉴定，发现细菌分离的阳性率高达82％。分离的细菌主要有链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、沙门氏菌和附红细胞体等。因此，为了我国养猪业的健康发展，在重视对猪的病毒性疾病防控的同时，我们一定也要加强对细菌性疾病的预防和治疗，以确保猪只的健康生长，而对细菌有效的鉴定是重要前提。
　　临床上鉴定病原菌常用的方法有分离培养技术、免疫学技术和PCR技术等，这些方法虽然都非常有效，但是各有缺点。基因芯片技术的出现，为致病菌的鉴定开辟了新的道路，它是分子生物技术与微电子技术融合的结晶，将大量已知的核苷酸序列固定于固相载体表面，通过碱基互补配对原则与标记的靶基因杂交，再对杂交信号进行扫描分析，可快速、准确的对致病菌作出鉴定。由于其微量、快速、准确、高通量等的优点，定会成为新一代的自动化疫病检测工具。
　　以多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌6种猪常见致病菌为目标细菌，16-23S rRNA基因为靶基因，从GenBank中下载它们16S rDNA、16-23S rDNA、23S rDNA的全序列，在16-23S rDNA的变异区设计针对6种细菌的特异性探针，在16S rDNA、23S rDNA的保守区设计通用引物。通过序列分析、靶标与探针杂交试验、杂交条件优化试验建立了由6条寡核苷酸探针和1对通用引物构成的猪常见致病菌基因芯片的检测方法。用参考菌株全基因组作为模板做PCR得到靶标，通过每种靶标与相应探针杂交，检出芯片的特异性良好。通过对芯片杂交条件的优化，发现PCR扩增产物和杂交缓冲液1∶4混匀在45℃水浴锅中与探针杂交lh，可获得理想的杂交结果。初步研究证明，该方法能快速、有效地鉴定多种猪常见致病菌。
　　总之，本研究将基因芯片检测技术应用于动物致病菌的检测，成功构建了6种猪常见致病菌基因芯片检测技术平台，具有重大的理论意义和应用价值。为今后利用基因芯片技术进行动物细菌病诊断和研究提供理论依据，也为控制和消灭疫情奠定基础。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1 基因芯片技术及其应用与发展

1．1 基因芯片技术

1．2 基因芯片技术的操作流程

1．3 基因芯片检测技术的应用

1．4 基因芯片技术的发展前景

2 致病菌检测技术的研究进展

2．1 传统的鉴定方法

2．2 自动化微生物分析仪

2．3 分子生物学技术

第二章 试验研究

试验一 六种猪常见致病菌基因芯片的构建

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

试验二 基因芯片杂交条件的优化

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 全文总结与创新点

参考文献

发表论文

附录

附录1：主要培养基和溶液的配制

附录2：缩略词