CCL1-CCR8在小鼠支气管哮喘发病机制中的作用及地塞米松对其作用的影响

摘要

背景及目的：
　　 支气管哮喘是一种比较高发的呼吸系统疾病,其中青少年占了相当大的比例。在我国,随着经济的高速增长、人们生活方式的转变,哮喘的发病率在逐年提高。目前传统经典的哮喘治疗方案-吸入性糖皮质激素和β2受体激动剂对于防治哮喘发挥了重要的作用,但仍存在许多不尽如人意的地方,亟需寻找新的治疗靶点和研制新型的抗哮喘药物。随着基因、分子技术的进步,目前已经认识到炎症趋化因子及其受体在炎性细胞趋化、募集过程中扮演了重要角色。而CCL1-CCR8就是一对重要的趋化因子和受体,在体外实验中CCL1具有趋化、募集CCR8+炎性细胞的作用,而作为受体-CCR8优势性地表达在Th2淋巴细胞上,Th2淋巴细胞又在支气管哮喘气道炎症形成上发挥了重要作用。CCL1-CCR8参与了多种炎症性疾病,但目前对其在支气管哮喘发病机制中作用和地位存在许多争议。另外糖皮质激素作为重要的抗炎药物,广泛的应用于哮喘治疗,但其抗炎机制仍未完全明晰,特别是其能否抑制CCL1-CCR8的表达?是否通过抑制CCL1-CCR8的表达来发挥抗炎作用?为此,本实验通过复制支气管哮喘小鼠模型,在哮喘模型的基础上于小鼠气道内滴注重组小鼠CCL1(rCCL1)来探索CCL1-CCR8在支气管哮喘发病机制中的作用,并应用地塞米松干预哮喘,研究其对CCL1-CCR8作用的影响。并藉此希望寻找到新的哮喘药物治疗靶点及糖皮质激素抗炎新机制。
　　 材料和方法：
　　 40只清洁级BALB/c雌性小鼠,随机分为4组,每组10只,分别为哮喘组、rCCL1干预组、地塞米松干预组、正常对照组。将新鲜配制的OVA和AL(OH)3的混悬液按0.2ml/只的剂量(含OVA100ug和AL(OH)32.25mg)于第1天、第14天以腹腔、皮下多点注射方式致敏小鼠,第25-31天,连续7天每天将小鼠置于密闭有机玻璃箱(40cm×35cm×20cm)中应用雾化器雾化吸入2％OVA液30分钟激发小鼠哮喘,制作哮喘模型。rCCL1干预组小鼠哮喘制作同哮喘组,但于最后一次激发后以0.3％戊巴比妥(30mg/kg)麻醉后经鼻道滴入rCCL1PBS液25ul/只(含2.5ugrCCL1)。地塞米松干预组小鼠哮喘制作同哮喘组,但在每次雾化激发前一小时给予腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液(2mg/kg)。正常对照组小鼠制作程序同哮喘组,但致敏液和雾化激发液均以生理盐水代替。最后一次激发后24h杀死小鼠,行肺泡灌洗,灌洗液离心,进行细胞分类、计数。肺组织HE染色,采用ELISA法检测肺泡灌洗液中的IL-4含量,逆转录-聚合酶链反应半定量(RT-PCR)检测肺组织中CCR8mRNA和CCL1mRNA表达的水平。实验数据应用SPSS12.0软件进行统计分析。
　　 结果：
　　 1症状比较:哮喘组小鼠OVA激发后出现典型的哮喘症状；rCCL1干预组哮喘症状更为明显,且有2只小鼠因出现重度哮喘导致死亡；地塞米松组小鼠较哮喘组小鼠明显减轻；正常对照组小鼠未见异常症状。
　　 2肺组织病理:肺组织HE染色显示哮喘组小鼠有较多炎性细胞浸润,肺组织结构有破坏；rCCL1干预组相比更为突出；地塞米松组小鼠较哮喘组减轻；正常对照组小鼠正常。
　　 3 BALF中IL-4浓度和细胞总数及分类:哮喘组、rCCL1组、地塞米松组和正常组小鼠BALF中细胞总数分别为(9.1±0.9)×106,(9.7±0.8)×106,(4.2±0.5)×106,(1.7±0.4)×106；BALF中嗜酸性粒细胞占细胞总数比例分别为(32.4±3.4)％,(39.0±7.1)％,(8.9±0.9)％,(0.6±0.1)％；BALF中淋巴细胞占细胞总数比例分别为(14.0±3.0)％,(17.8±4.2)％,(6.3±0.6)％,(2.9±0.5)％:BALF中IL-4水平分别为(47.67±11.67)pg/ml,(57.95±9.24)pg/ml,(19.76±4.72)pg/ml,(5.16±1.23)pg/ml。
　　 4肺组织CCL1mRNA-CCR8mRNA表达:哮喘组、rCCL1组、地塞米松组和正常组小鼠肺组织中CCL1mRNA表达水平分别为0.76±0.16,1.02±0.31,0.53±0.13,0.11±0.06;CCR8mRNA表达水平分别为1.26±0.13,1.43±0.26,0.79±0.12,0.18±0.09。
　　 5统计学分析:BALF中IL-4水平、细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞数量均rCCL1干预组>哮喘组>地塞米松组>正常对照组(差异均具有统计学意义P<0.05),同时在CCL1mRNA及CCR8mRNA的表达水平上也是rCCL1干预组>哮喘组>地塞米松组>正常对照组(差异均具有统计学意义P<0.05)。
　　 结论：
　　 1、CCL1-CCR8在哮喘小鼠肺内表达增高,在哮喘气道炎症的形成上发挥了重要作用；
　　 2、地塞米松可以抑制哮喘小鼠肺内CCL1-CCR8的表达并以此减轻了哮喘气道炎症；
　　 3、CCL1-CCR8可能是哮喘药物治疗的新靶点。

目录

文摘

英文文摘

CCL1-CCR8在小鼠支气管哮喘发病机制中的作用及地塞米松对其作用的影响

引言

材料与方法

1.1 小鼠

1.2 试剂

1.3 仪器

1.4 实验方法

1.5 统计学处理

结果

2.1 症状比较

2.2 BALF中IL-4浓度和细胞总数及分类

2.3 肺组织病理

2.4 各组小鼠CCL1mRNA和CCR8mRNA表达情况

2.5 相关性分析

讨论

3.1 哮喘动物模型的制作

3.2 炎性细胞与支气管哮喘

3.3 CCL1-CCR8与支气管哮喘

3.4 糖皮质激素对CCL1-CCR8的影响

3.5 CCL1-CCR8在哮喘发病机制中的意义

结论

附图

5.1 各组小鼠肺组织病理切片

5.2 各组小鼠CCL1、CCR8电泳图

参考文献

综述部分

炎症趋化因子及其受体与支气管哮喘

参考文献

英文缩略词表

个人简历

硕士期间发表论文

致谢