幽门螺杆菌ureB基因在乳球菌中食品级表达及免疫反应性

摘要

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是胃炎、胃癌和消化道溃疡的重要病因。目前临床主要用抗生素和抑酸剂联合疗法,虽然取得了一定疗效,但抗生素经济负担高、耐药株出现和药物的副作用等使得抗生素治疗受限。在此情况下,疫苗就成了最有效的方法,具有很好的应用前景。
　　 尿素酶(Urease,Ure)是H.pylori的主要致病因子,UreB亚基已经通过基因工程在大肠杆菌中表达,并在粘膜免疫佐剂配合下,能引起免疫应答。所有的经口免疫模型必须用霍乱毒素(Cholera toxin,CT)或大肠杆菌不耐热肠毒素(E.coli labile toxin,LT)作为免疫佐剂。但是CT和LT都有一定的毒性而不能用于人体,加上目前疫苗大多采用鼠伤寒减毒沙门氏菌为抗原提呈载体,对免疫力低下的人群危害大,限制了疫苗的使用。
　　 但用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)做为活菌疫苗的宿主菌,就可以避免上述危害。但传统的基因改良菌往往以抗生素抗性基因作为筛选标记,这就存在潜在的因生物转基因污染而引起的抗生素耐药的危害。因此完全的食品级表达系统的研发一直是该领域的热点。
　　 材料与方法
　　 1.从重组质粒pMD19-T-ureB双酶切得到ureB基因；双酶切胶回收乳酸菌载体pNZ8149(该载体以lacF基因为筛选标记),连接后电转化入lacF基因缺失的乳酸乳球菌NZ3900。挑阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。
　　 2.用正交试验,对影响目的蛋白诱导产量的因素,如诱导剂浓度、诱导时机和诱导持续时间进行实验,用Brandford法测定目的蛋白浓度,通过方差分析得出最适宜表达条件。
　　 3.纯化重组大肠杆菌TB1/pMAL-C2X-UreB的诱导产物MBP-UreB,混合弗氏免疫佐剂免疫小鼠,制备抗UreB免疫血清。用Western-blot免疫印迹法研究重组乳球菌NZ3900/pNZ8149-ureB表达的UreB蛋白的免疫反应性。
　　 结果：
　　 1.PCR扩增、酶切鉴定,食品级表达载体pNZ8149-ureB构建成功,转化得到重组工程菌NZ3900/pNZ8149-ureB。重组菌用乳联菌肽(Nisin)诱导后,SDS-PAGE电泳可见64.1KD的目的蛋白UreB。
　　 2.正交实验表明,各因素对实验结果影响大小次序是:诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间,只有诱导时机对实验结果的影响有统计学意义；表达条件的最优组合:在菌体培养到OD600为0.4时加入终浓度为25ng/mL的Nisin,诱导表达5h。
　　 3.制备的小鼠抗UreB血清,经ELISA鉴定效价为1:800。将乳酸菌诱导表达的目的蛋白UreB转移到硝酸纤维膜上,用制备的小鼠血清进行Western blot分析,可在相应位置显示杂交条带,说明乳酸菌诱导表达的UreB具有良好的免疫反应原性。
　　 结论：
　　 1.成功构建了表达UreB的不含任何抗生素抗性筛选标记的乳酸乳球菌食品级原核表达系统。
　　 2.利用正交实验获得了重组工程菌NZ3900/pNZ8149-ureB的最优表达条件。
　　 3.乳酸乳球菌食品级表达系统诱导表达的UreB蛋白有良好的免疫原性,为研制H.pylori的直接口服疫苗奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

图表索引

英文缩略词表

引言

总技术路线图

第一部分 幽门螺杆菌ureB基因乳酸菌原核表达载体的构建

材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

结果

1.1 幽门螺杆菌ureB基因获取

1.2 乳酸乳球菌表达载体pNZ8149酶切结果

1.3 阳性克隆子NZ3900/pNz8149-ureB的筛选鉴定

讨论

1 抗原基因的选择

2.原核表达系统的选择

3.目的蛋白对宿主菌生长的影响

小结

第二部分 幽门螺杆菌ureB基因乳球菌食品级表达系统中表达条件的优化材料与方法

材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

结果

1.Brandfbrd法蛋白标准曲线

2.NZ3900/pNZ8149-ureB和对照NZ3900、Nz3900/pNZ8149-ureB诱导产物SDS-PAGE电泳结果

3.NZ3900/pNZ8149-ureB各样品诱导表达UreB蛋白占总蛋白的比例及浓度

4.方差分析结果及表达条件优化分析

5.根据优化条件表达目的蛋白SDS-PAGE电泳结果

讨论

小结

第三部分 乳酸乳球菌NZ3900表达UreB蛋白的鉴定和免疫反应性

材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

结果

1. 工程菌TB1/pMAL-C2X-UreB诱导表达产物SDS-PAGE电泳

2.Bradfbrd法测定目的蛋白含量

3.ELISA法测定小鼠血清抗体

4.乳酸菌NZ3900表达UreB蛋白免疫反应性鉴定结果

讨论

小结

结论

参考文献

综述部分

1.乳酸菌的生理功能

2.乳酸菌与粘膜免疫系统

3.乳酸菌作为黏膜免疫疫苗的活菌载体

4.乳酸菌食品级表达载体

5.研究的热点和展望

参考文献

个人简历

致谢