P53蛋白促进大鼠肝原代细胞增殖的机制

摘要

1.目的：
　　p53基因与肿瘤的发生密切相关，在所有恶性肿瘤中，50％以上会出现该基因的突变。人们普遍认为P53起到抑制细胞增殖的作用，但在肝细胞中发现抑制P53功能的同时也抑制了细胞增殖。提示P53对于细胞增殖具有促进作用。最近有文献报道P53是人源性或鼠源性TGFα的转录起始因子，同时P53也可以激活MAPK途径，提示P53有促进细胞增殖作用。本研究主要探索P53促进细胞增殖的机理。
　　2.方法：
　　2.1、细胞提取和培养
　　雄性成年Wistar大鼠，重200～220克，饲养在12小时阳光12小时黑夜条件下。肝原代细胞使用改良的体外胶原酶灌注两步分离术提取。细胞死亡由台盼蓝染色计数。细胞种植密度为20000个/cm2。无血浆培养液由Williams Medium E培养基和Dulbecco's modified Eagle's medium按等比例混合，最终葡萄糖浓度为8.4mmol/L。培养基中加入青霉素(67mg/L)，链霉素(100mg/L)，地塞米松(25nmol/L)和胰岛素(100umol/L)。在种植前3个小时使用5％血浆培养基培养。然后使用无血浆培养液培养在37℃，5％CO2条件下。实验使用10nmol/L的EGF刺激细胞。
　　2.2、Western Blotting检测蛋白
　　培养的肝原代细胞使用Tris-lysis buffer(pH7.4，含60mmol/L的Tris-HCl，10％甘油，3％的硫酸钠(SDS)，1mol/L的EDTA，0.2mmol/L的AEBSF,20μmol/L亮肽素，200U/mL的抑肽酶，65μmol/L钒酸钠和10mmol/L的β-甘油磷酸）裂解。然后裂解液进行超声。所有样本的蛋白浓度使用DC protein assay检测(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，并调整到相同浓度，最终加入β-巯基乙醇和溴酚蓝并使它们的浓度分别为5％和0.0025％。样品煮上4分钟并贮存于-20℃条件下。样品蛋白进入凝胶电泳分离并转移至硝化纤维膜上进行随后的分析。硝化纤维膜使用含5％牛奶的Tris-buffered saline溶液封闭，然后使用含1％牛奶的Tris-buffered saline的一抗溶液4℃孵育过夜。实验中使用以下抗体:鼠源性的抗Cyclin E抗体和抗P53抗体，购自Cell Signalling Technology公司，兔源性的抗Cyclin D1抗体和鼠源性的抗P21抗体，购自Upstate Biotechnology公司，抗Thr202/204位点磷酸化的Erk抗体和抗CDK4抗体，购自Cell Signalling Technology公司，鼠源性抗β-tubulin抗体，购自Sigma-Aldrich公司，购自Fitzgerald公司，兔源性抗pY1173位点磷酸化的EGF受体抗体。
　　冲先后，硝化纤维膜孵育二抗溶液90分钟，二抗为HRP连接的山羊源性抗兔IgG抗体和驴源性抗鼠IgG抗体及驴源性抗绵羊性IgG抗体，购自Sigma Aldrich公司。荧光使用加强的化学荧光(ECL)法检测。
　　2.3、放射渗入法检测细胞增殖
　　肝细胞在六孔板上如上培养。细胞种植后48小时加入氚标记的胸苷(1μCi/ml)。DNA合成程度由检测到的细胞吸收的放射性胸苷来表示。六孔板由三氯乙酸冲洗两次，每次10分钟。剩下的细胞由0.3ml的1mol/L KOH溶解，放射性由液体闪烁仪计数。蛋白浓度测定如上。
　　2.4、ELISA检测TGFa浓度
　　收集培养液并根据ELISA法说明步骤检测TGFa(灵敏度为5pg/ml)浓度。将针对TGFa膜外部分抗原决定族和整个TGFa分子抗原决定族的多克隆抗抗体固定到检测板上（捕获抗原），冲洗检测板，将同量的不同组的样品与羊抗人源性的TGFa抗体混合，然后加到检测板上。3小时孵育后，冲洗检测板3次后漂洗1次去除未与检测板结合的物质。链霉卵白素-过氧化物酶孵育样本30分钟。冲洗3次和漂洗1次后，在无光环境下发色底物邻苯二胺孵育样本后使用硫酸终止反应。使用TGFa干粉和蒸馏水及缓冲液配制的250，125，and63pg/ml及其它合适浓度溶液作为标准浓度，分光光度计在490nm检测样本浓度。为了排除操作过程中溶液含有影响检测的因子，同时检测由缓冲液和操作溶液等比例混合配制的浓度为63，125，250pg/ml和其它合适浓度的标准液。所有的检测使用相同的处理步骤。
　　2.5、免疫荧光检测蛋白细胞内分布
　　4％甲醛溶液固定新鲜的细胞样品10min。PBS溶液冲洗2×10min后，室温干燥30min，待样品表面无多余液体后加一抗至细胞表面，置于湿盒内，室温孵育过夜。然后PBS溶液冲洗2×10min，加荧光标记二抗溶液至细胞表面，置于湿盒内，室温孵育1小时。然后PBS溶液冲洗2×10min，室温干燥30min，待样品表面无多余液体后，将盖玻片固定在载玻片表面，使用共聚焦显微镜进行观察（60×油镜）。
　　3、结果：
　　3.1、P53与细胞增殖
　　1)EGF刺激细胞后激活P53功能
　　在培养液中添加EGF刺激细胞24小时或30小时后，细胞中P21的表达升高;而P53抑制剂pifithrin-α可以完全阻断EGF诱导生成P21。上述结果表明EGF刺激细胞后可激活P53，进而促进转录生成P21。
　　2)Cyclin D的表达依赖P53激活
　　在培养液中添加EGF刺激细胞24小时和30小时后，细胞中Cyclin D的表达升高，而P53抑制剂pifithrin-α可以阻断此一过程。结果显示Cyclin D的生成依赖P53的激活。
　　3)P53与细胞增殖的剂量反应关系
　　按在肝细胞EGF刺激1小时前使用P53抑制剂及抑制剂浓度分组，细胞受EGF刺激30小时后使用放射渗入法检测各组细胞的增殖水平。结果显示P53抑制剂pifithrin-α可以抑制EGF诱导的肝细胞增殖，pifithrin-α浓度与细胞增殖存在剂量反应关系，当pifithrin-α浓度高至30μmol/L时，将完全抑制肝细胞的增殖。
　　4)P53与细胞增殖的时效关系
　　按加入P53抑制剂pifithrin-α到细胞培养液的时间点分组，EGF刺激30小时后使用放射渗入法检测各组细胞的增殖水平。在EGF刺激细胞1小时前或第12小时使用pifithrin-α，肝细胞增殖将会完全受到抑制，而第24小时使用pifithrin-α则细胞增殖受到部分抑制。结果显示，P53激活对细胞增殖的影响主要发生在EGF刺激细胞12小时后。
　　3.2、P53促进细胞增殖的机制
　　1)细胞分泌TGFα依赖P53激活
　　EGF刺激肝细胞后24小时收集培养液，使用ELISA检测培养液中TGFα的水平（以三次实验结果的均数表示）。结果显示在未给予EGF刺激的肝细胞培养液中TGFα低于8pg/ml，而在EGF刺激的肝细胞培养液中TGFα为38.24pg/ml。而如果在给予EGF刺激前1小时应用P53抑制剂pifithrin-α，则培养液中的TGFα为12.3pg/ml。所以EGF刺激细胞分泌TGFα依赖P53的激活。
　　2)TGFα与细胞增殖的剂量反应关系
　　EGF刺激细胞30小时后使用放射渗入法检测细胞的增殖水平。按在肝细胞EGF刺激1小时前使用中和抗体及抗体种类浓度分组，检测各组细胞的增殖情况。结果显示TGFα中和抗体可以抑制肝细胞增殖，而当TGFα中和抗体浓度高至0.5mg/L时，将完全抑制肝细胞的增殖。说明肝细胞自分泌的TGFα和细胞增殖存在剂量反应关系。
　　分别将对照抗体和TGFα中和抗体与EGF混合溶解于100ul培养液中，1小时后将此混合液分别加入正常的肝细胞培养液中，10分钟后使用WESTERN BLOTTING法检测细胞的EGF受体和ERK1/2的磷酸化水平。结果显示，TGFα中和抗体与EGF的混合液并未影响EGF受体和ERK1/2的磷酸化水平，说明TGFα中和抗体与EGF并未发生特异性的交叉反应。
　　3)TGFα与细胞增殖的时效关系
　　在EGF刺激细胞后不同时间加入TGFα抗体中和培养液中细胞分泌的TGFα，EGF刺激30小时后使用放射渗入法检测各组细胞的增殖水平。结果显示，在EGF刺激细胞1小时前或第12小时使用TGFα中和抗体，肝细胞增殖将会完全受到抑制，而在第24小时使用TGFα中和抗体，则细胞增殖受到部分抑制。说明细胞分泌的TGFα主要在EGF刺激细胞12小时后起作用，与P53促进细胞增殖具有相同的时效关系，提示P53通过TGFα促进细胞增殖。
　　3.3、TxGFα促进细胞增殖的机制
　　1)TGFα促进CyclinD表达
　　TGFα促进细胞增殖的作用主要发生在EGF刺激细胞12小时后，因此在EGF刺激细胞12小时后加入培养液TGFα中和抗体，在24小时和30小时收获细胞。结果显示，TGFα中和抗体抑制Cyclin D的表达，说明细胞分泌的TGFα起到促进Cyclin D表达的作用。证实了P53抑制Cyclin D的表达是通过TGFα实现的。
　　2)TGFα促进Cyclin D细胞核内分布
　　Cyclin D的功能也依赖其在细胞内的分布，当EGF刺激细胞30小时后，Cyclin D和CDK4均位于细胞核内，而如果不给予细胞EGF刺激，则Cyclin D和CDK4均位于细胞质内。当使用鼠源性的TGFα单克隆抗体中和培养液中细胞分泌的TGFα后，Cyclin D和CDK4与不给予EGF刺激细胞的情况相似，仍位于细胞质中未进入细胞核内，说明细胞分泌的TGFα起到促进Cyclin D和CDK4细胞核内聚集的作用。
　　4.结论：
　　EGF刺激肝原代细胞后可引起P53蛋白激活，P53进入细胞核后促使TGFα基因进行转录，转录生成的TGFα可由细胞分泌到细胞外，TGFα可与EGFR受体结合刺激细胞，诱导Cyclin D蛋白合成和细胞核内聚集，促进细胞增殖。

目录

声明

摘要

英文缩略词

1．引言

2．方法

2．1 主要材料

2．2 细胞提取和培养

2．3 Western blotting

2．4 放射渗入法检测细胞增殖

2．5 ELISA法检测TGFα浓度

2．6 免疫荧光检测蛋白细胞内分布

2．7 技术路线

3．结果

3．1 P53与细胞增殖

3．2 P53促进细胞增殖的机制

3．3 TGFα促进细胞增殖的机制

4．讨论

4．1 P53具有促进细胞增殖的作用

4．2 P53通过TGFα发挥促进细胞增殖的作用

4．3 TGFα通过促进CyclinD的核内聚集和表达促进细胞增殖

5．结论

参考文献

综述1：细胞增殖与肿瘤

综述2：P53

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

参加的会议