SPIN1负调控p53蛋白稳定性促进肿瘤细胞增殖的作用及分子机制

摘要

研究背景及研究目的： 作为“基因组看护者（genomic gatekeeper）”，p53是在机体内的表达水平受到精密而严格的调控，研究发现p53基因在约50%的肿瘤组织中是突变的，而在剩下的50%具有野生型p53的肿瘤中，其活性因受到其它癌基因的抑制使得p53的表达始终维持在一个较低的水平。MDM2除了作为p53最主要的负调控因子之外，同时还是p53下游转录激活的靶基因之一，因此，MDM2和p53之间形成了一个负反馈环路。近年来有研究结果发现一系列细胞刺激和调控因子能通过抑制MDM2-p53反馈环路，激活p53蛋白的表达，进而抑制肿瘤细胞的恶性进展，例如p19ARF等。核糖体蛋白（Ribosomal Proteins，RPs）-MDM2-p53信号轴是新近发现的能影响p53活性的一条新通路。核糖体RNA（ribosome rRNA，rRNA）的合成受阻或剪切异常、核糖体蛋白和某些核仁蛋白的功能失调、核糖体亚基的组装异常以及化学药物刺激等都会破坏核糖体的生物合成过程，产生“核糖体刺激”（也称作“核仁刺激”，ribosomal stress或nucleolar stress）。一旦发生核糖体刺激，将会导致一系列核糖体蛋白（RPs），例如RPL5、RPL11、RPL23、RPLS7和RPS14等，从细胞核仁转位至细胞核浆并与MDM2结合，进而阻断其对p53的E3泛素化降解作用，以维持细胞稳态。既往研究已经鉴定了一些能调控RPs-MDM2-p53信号轴的上游分子，例如PICT1能抑制RPL11的活性调控MDM2-p53信号通路，SRSF1能与RPL5-MDM2形成复合物稳定p53的表达，但是否还存在其他分子介导RPL5-MDM2-p53信号通路的活性尚不清楚。SPIN1（Spindlin1）能否通过负调控p53信号通路促进肿瘤细胞增殖是本项研究的论证重点，本研究将从分子生物学、细胞生物学、临床标本及生物信息学等多角度进行探索和验证，试图阐明SPIN1调控p53蛋白表达及活性的分子机制，并证明SPIN1在调控肿瘤细胞恶性增殖过程中的重要作用及靶点价值。本研究的开展将有助于深入阐明肿瘤细胞恶性增殖的分子机理，有望为肿瘤患者的靶向治疗提供新方向。 研究方法： 第一部分：鉴定SPIN1是能与RPL5相互作用的蛋白 1、RPL5-MDM2-p53信号轴是一种重要的能维持机体稳态的细胞防御机制，可有效地防止由异常的致癌活性引起的细胞生长失控。为了寻找介导此信号通路活性的上游调控分子，本课题组前期成功构建过表达RPL5的稳定细胞系，采用免疫共沉淀-质谱分析实验（IP-MS）探索可能与RPL5相互作用的蛋白分子，其中SPIN1引起了我们课题组的关注。 2、为了证实SPIN1与RPL5能否互相作用，本课题组首先利用基因克隆技术成功构建了Myc-SPIN1、Flag-RPL5、Flag-SPIN1及GFP-RPL5等质粒，通过免疫共沉淀实验（Co-IP）分别检测SPIN1和RPL5外源性和内源性条件下的结合情况。 3、为了理解SPIN1和RPL5相互作用的分子机制，我们分别构建了带有GST标签的GST-SPIN1的全长及截断片段、GST-RPL5的全长及截断片段，并在细菌中纯化His-SPIN1和His-RPL5，采用GST pull down实验证实SPIN1和RPL5能否直接结合，并确定两者的结合位点。 第二部分：SPIN1促进肿瘤细胞增殖的作用及机制研究 1、为研究SPIN1对p53的调控作用，利用siRNA分别干扰p53野生型的骨肉瘤U2OS、肺癌H460和结肠癌HCT116细胞中SPIN1的表达，采用Western blotting和实时定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中干扰SPIN1的表达后p53及其下游靶基因表达的变化。 2、为了研究SPIN1在肿瘤细胞增殖过程中所起到的作用并验证其作用是否依赖于调控p53的表达，我们成功构建了干扰SPIN1表达的shRNA质粒，分别转染至p53野生型和p53缺失型结肠癌细胞（HCT116p53+/+和HCT116p53-/-）中，采用CCK-8、克隆形成实验及流式细胞仪凋亡分析等评价SPIN1对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响；并采用Western blotting检测在HCT116细胞中检测干扰SPIN1对p53及其下游靶基因p21及PUMA的蛋白表达的影响。 3、为进一步明确SPIN1对肿瘤细胞增殖能力的影响是否依赖于p53信号通路，利用慢病毒感染技术建立了稳定干扰SPIN1的结肠癌HCT116细胞株（HCT116p53+/+-scramble shRNA、HCT116p53+/+-SPIN1 shRNA、HCT116p53-/--scramble shRNA和HCT116p53-/--SPIN1 shRNA），同时建立肿瘤裸鼠皮下移植瘤模型，观察移植瘤在体内的生长情况，并采用Western blotting和qRT-PCR检测瘤体组织中p53信号通路的变化。 4、收集新鲜术后结肠癌标本和正常结肠组织标本，采用Western blotting验证SPIN1在结肠癌组织中的表达是否升高，并采用网络平台Oncomine等数据库（https://www.oncomine.org/）分析SPIN1在多种肿瘤中的表达情况。 第三部分：SPIN1负调控p53蛋白稳定性的功能及机制探讨 1、为进一步研究SPIN1如何调控 p53的蛋白表达，我们采用CHX（cycloheximide，放线菌酮）追踪实验检测调控SPIN1的表达对p53蛋白半衰期的影响，利用体内泛素化等一系列实验观察过表达 SPIN1对 MDM2介导的p53泛素化降解作用的影响，并在p53和MDM2双重缺失的MEF p53-/-; MDM2-/-细胞中转染过表达SPIN1和p53的质粒，验证SPIN1对p53的调控作用是否依赖于MDM2。 2、为确定SPIN1是否通过抑制RPL5-MDM2相互作用进而调控p53蛋白活性，我们采用免疫共沉淀（Co-IP）实验检测过表达SPIN1对RPL5-MDM2结合情况的影响，采用免疫荧光实验验证SPIN1和RPL5的共定位情况。 3、采用Ribosome profiling（核糖体质谱分析）、免疫共沉淀（Co-IP）及qRT-PCR等一系列实验验证干扰SPIN1的表达能否通过抑制rRNA生成诱发核糖体刺激，增加游离状态的核糖体蛋白RPL5/RPL11与MDM2的结合，进而激活p53的蛋白表达及转录活性。 结果： 第一部分：鉴定SPIN1是能与RPL5相互作用的蛋白 1、免疫共沉淀质谱（IP-MS）分析方法发现了一批能与RPL5结合的蛋白，有一些已经被证实可与RPL5结合并能调控p53活性，其中，SPIN1因其与rRNA生成及肿瘤发生发展密切相关被选为我们进一步的实验对象。 2、本项目采用免疫共沉淀（Co-IP）实验证实SPIN1能和RPL5特异性地外源性结合，却不能和其它核糖体蛋白RPL11及RPL23相互结合；此外，我们还发现 SPIN1能特异性地与RPL5内源性结合。 3、GST pull down实验的结果发现SPIN1和RPL5能特异性地相互直接结合，且SPIN1可通过其第二个Tudor结构域与RPL5结合，而SPIN1能特异性地结合RPL5的N端和C端。 第二部分：SPIN1促进肿瘤细胞增殖的作用及机制研究 1、在p53野生型的骨肉瘤U2OS、肺癌H460和结肠癌HCT116细胞中，干扰SPIN1会显著增加p53及其下游靶基因p21、MDM2及PUMA的蛋白表达；此外，在HCT116细胞中干扰SPIN1会显著增加p21及PUMA的mRNA表达水平，过表达SPIN1则会产生相反的效应，但不论是沉默还是过表达SPIN1，对p53本身的mRNA表达无影响。 2、干扰SPIN1的表达能显著抑制结肠癌HCT116细胞的增殖活性及平板细胞克隆形成能力，加快细胞凋亡，且对HCT116 p53+/+细胞的作用比HCT116 p53-/-细胞更加显著。 3、裸鼠模型进一步证实沉默SPIN1能显著抑制裸鼠移植瘤的生长能力，相应的，Western blotting和qRT-PCR实验证实沉默SPIN1的表达主要通过激活p53蛋白及其下游靶基因PUMA等的表达抑制瘤体的生长增殖能力，但SPIN1仍具有非p53依赖性的促肿瘤细胞恶性增殖的能力。 4、临床标本分析显示SPIN1在结肠癌组织中的表达显著高于正常结肠组织，网络平台 Oncomine数据库的分析结果证实 SPIN1在多种肿瘤中均出现不同程度的高表达，例如胃癌、乳腺癌、黑色素瘤等。 第三部分：SPIN1负调控p53蛋白稳定性的功能及机制探讨 1、CHX实验证实干扰SPIN1的表达能显著延长p53蛋白的半衰期，而过表达SPIN1则能缩短 p53蛋白的半衰期；体内泛素化实验的结果显示过表达SPIN1能促进MDM2介导的p53泛素化降解作用，且这种作用呈剂量依赖性；此外，在p53和MDM2双重缺失的小鼠成纤维细胞MEF p53-/-;MDM2-/-中，过表达SPIN1不能改变外源性表达的p53蛋白的表达水平，因此SPIN1对p53的降解抑制作用是依赖于MDM2的。 2、免疫共沉淀（Co-IP）实验的结果证实过表达SPIN1能呈剂量依赖性地特异性地抑制RPL5-MDM2的外源性结合作用，对RPL11-MDM2的相互作用无影响；此外激光共聚焦实验技术的结果显示 SPIN1和 RPL5能共定位于细胞核仁结构。 3、qRT-PCR的结果发现干扰SPIN1会抑制rRNA的生成，并且Ribosome profiling的结果证实沉默 SPIN1能诱发核糖体刺激，增加游离状态的 RPL5和RPL11的表达，促进内源性RPL5/RPL11-MDM2相互作用，激活p53的蛋白表达；此外，不论是干扰RPL5还是RPL11都会阻断沉默SPIN1对p53的激活作用，证实这些游离状态的核糖体蛋白RPL5/RPL11在SPIN1对p53的负调控作用过程中起着重要的作用。 结论： 1、SPIN1是能与RPL5特异性地直接结合的蛋白分子，且SPIN1可通过其Tudor2结构域与RPL5结合，而SPIN1能特异性地结合RPL5的N端和C端； 2、细胞功能学及体内裸鼠实验证实干扰SPIN1的表达能通过激活p53信号通路显著抑制结肠癌肿瘤细胞的恶性增殖能力；临床样本验证发现SPIN1在结肠癌组织中的表达显著升高，数据库分析提示SPIN1在多种肿瘤中均有不同程度的高表达； 3、SPIN1负调控p53蛋白表达及活性促肿瘤生成发展的分子机制主要有两部分：一方面SPIN1将RPL5限制于核仁，减少RPL5与MDM2的结合，促进MDM2对p53的泛素化降解；另一方面，干扰SPIN1能通过诱发核糖体刺激，释放游离状态的核糖体蛋白RPL5/RPL11与MDM2结合，稳定p53蛋白。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

第一部分 鉴定SPIN1是能与RPL5相互作用的蛋白

1.引言

2. 材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3. 实验结果

3.1 免疫共沉淀质谱（IP-MS）分析筛选能与RPL5相互作用的蛋白

3.2 质谱分析差异表达条带

3.3 免疫共沉淀验证SPIN1能与RPL5结合

4. 讨论

5. 结论

第二部分 SPIN1促进肿瘤细胞增殖的作用及机制研究

1. 引言

2. 材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3. 结果

3.1 检测调节SPIN1的表达对p53及下游通路靶基因表达的影响

3.2 检测下调SPIN1的表达对细胞增殖、克隆形成及凋亡的影响，并验证其作用是否依赖于p53。

3.3 裸鼠成瘤实验检测干扰 SPIN1 的表达对瘤体生长及 p53 信号通路的影响

3.4 利用临床标本和Oncomine数据库分析SPIN1在肿瘤组织中的表达情况

4. 讨论

5. 结论

第三部分：SPIN1负调控p53蛋白稳定性的功能及机制探讨

1. 引言

2. 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3. 实验结果

3.1 过表达SPIN1对MDM2介导的p53泛素化降解作用的影响

3.2 过表达SPIN1对RPL5的功能及RPL5-MDM2结合情况的影响

3.3 干扰SPIN1的表达后能通过抑制rRNA的生成诱发核糖体刺激

4. 讨论

5. 结论

全文总结

致谢

参考文献

攻读学位期间主要的成果

综述:RPs-MDM2-p53调控轴的作用及研究进展