一种负调控植物程序性细胞死亡和促进转基因愈伤组织生长分化的水稻锌指蛋白基因

摘要

本发明提供一种水稻锌指蛋白基因，该基因与拟南芥LSD1基因类似，含有三个锌指结构域，被命名为OsLSD1，编码一个含143个氨基酸的蛋白。该基因的表达受稻瘟病菌完全抑制。对OsLSD1的转基因水稻观察结果表明OsLSD1蛋白是植物程序性细胞死亡的负调控因子，并能促进水稻转基因愈伤组织生长分化。表达OsLSD1的转基因烟草提高了对致癌性微生物毒素fumonisin B1(FB1)的耐受性，表明该基因(或其产物)具有抗细胞死亡的功能。

说明书

技术领域

本发明属植物分子生物学领域。具体地说，本发明涉及通过对水稻cDNA文库的测序和分析，得到一个与拟南芥LSD1(lesions simulatingdisease resistance 1)基因同源的水稻cDNA，命名为OsLSD1(Oryza sativahomolog of LSD1)。该cDNA含有一个432bp的开放阅读框，编码143个氨基酸。该蛋白质含有三个锌指结构域，与拟南芥LSD1蛋白相似。Northern杂交结果表明该基因的表达受稻瘟病菌完全抑制。构建了三种植物表达载体pCOsLSD1-S，pCOsLSD1-A，pCOsLSD1-R，转基因水稻结果表明OsLSD1基因是植物程序性细胞死亡的负调控因子，并能促进转基因愈伤组织的生长分化。表达OsLSD1的转基因烟草提高了对致癌性微生物毒素fumonisin B1(FB1)的耐受性，表明该基因(或其产物)具有抗细胞死亡的功能。

背景技术

植物在生长发育和抗病、抗逆过程中有各种不同的程序性细胞死亡。植物在抗病反应过程中，通过植物自身的抗病基因与病原物的无毒基因的相互作用，引发一系列的防卫反应(Bent，1996)，其中最常见的是过敏反应(hypersensitive response，HR)。过敏反应是指当植物受非毒性病原菌侵染后，在侵染区形成与健康组织明显分开的坏死斑从而限制病原物在侵染处生长的反应过程。相反，如果植物受毒性病原菌侵染则不产生过敏反应而是引起植株发病。植物与病原微生物相互作用的过敏性反应是植物主动防卫，是一种程序性细胞死亡。过敏反应与活性氧猝发、防卫基因的激活、抗菌物的集合以及植物细胞壁的变化紧密相关(Hammond-Kosack et al.，1996)。一般认为，HR是植物细胞主动死亡，是受植物遗传基因控制的。过敏反应是植物抗病反应中最基本的一种反应，阐明过敏反应的过程和机制是植物抗病研究的重点和热点。研究过敏反应机制和过程的方法之一是利用假病斑突变体。植物在没有明显的逆境、损伤或病原物侵染时就能自发地形成细胞死亡，在叶片上形成坏死斑，其症状与病原物侵染后形成的坏死症状非常相似，这种突变体被称为假病斑突变体(disease lesion mimics)。这种假病斑突变体已经在拟南芥、玉米、大麦和水稻等植物中发现。到目前为止，已有数个与假病斑有关的基因从拟南芥、玉米和大麦和水稻中被克隆，它们的功能也从分子水平上给予了阐述。

lsd1突变体是单基因隐性突变，对各种细胞死亡的诱导剂超敏感，并且不能控制细胞死亡的程度(Dietrich et al，1994)。在长日照条件下(16hr光照/8hr黑暗)表现坏死，而在短光照条件下坏死受到抑制。从短光照移到长光照下2-3天后坏死就开始出现，坏死斑随机地分布在叶片上，7-10天后坏死斑布满整个叶片。这种突变是条件致死型，长日照条件下开花之前整株就会死亡。lsd1突变体在叶片没有出现坏死斑时就表现出对细菌、真菌的非特异性抗性。在利用图位克隆方法克隆了该基因后，发现LSD1基因编码的蛋白质含有三个锌指结构域，与锌指蛋白以及转录因子具有较高的同源性(Dietrich et al.，1997)。Kliebenstein等发现LSD1的功能是在诱导CuZnSOD蛋白产生的信号传导途径中起部分作用，而CuZnSOD蛋白对水杨酸(SA)做出应答反应。并因此推测在lsd1突变体中由于缺乏LSD1，也就缺少了CuZnSOD蛋白的上调因子(upregulator)，造成超氧化物的积累，最终形成坏死斑。EDS1和PAD4是lsd1突变体失控细胞死亡(Runaway Cell Death，RCD)信号传导途径的必要成分(Rusterucci et al.，2001)。

拟南芥中还存在一种加速细胞死亡的突变体(accelerated cell death，acd)，其中acd2突变体可自发地形成类病斑坏死，并组成型表达对病原菌的抗性，光照条件下病原菌也可刺激病斑的形成。最近Mach等克隆了ACD2基因，通过序列同源性分析，其产物与红叶绿素降解物还原酶(Red Chlorophyll Catabolite Reductase，RCCR)相似。该酶在催化叶绿素卟啉组分的降解反应中起催化作用。因此他们推测acd2突变体中，细胞死亡是由于叶绿素降解物的积累所致，这些产物可能激发一些特定开关的启动，造成细胞死亡或者它们通过吸收光并转移电子而产生自由基引起细胞的损伤，进而导致细胞死亡。相关的研究佐证了他们假设的可能性，在受到病原菌(Pseudomonas syringae)侵染的转基因植株中，ACD2蛋白的过量表达可有效地减少发病症状，但并不能减少细菌的生长。暗示叶绿素的降解物会加重发病症状，包括细胞的死亡与植株黄化。

大麦假病斑突变体mlo也是在没有病原菌的情况下出现类似于病斑的细胞死亡。mlo突变体对大麦白粉病(Erysiphe graminis f.sp.Hordei)所有生理小种表现为广谱抗性。该基因编码一个60kDa含有六个跨膜螺旋(membrane-spanning helices)结构的蛋白。MLO蛋白可能有双功能，不但能抑制细胞死亡，而且对抗白粉病有关键作用(Buschges et al.1997)。有趣的是，mlo突变体对水稻稻瘟病菌表现为感病性增强(Jaroschet al.，1999)，说明MLO在大麦对不同病原菌的反应中有不同的功能或传递不同信息。

另一个克隆的假病斑突变体是玉米lls1(lethal leaf spotl)突变体，该突变体对两类真菌病害表现出非特异性抗性(Simmons et al.，1997)，并通过转座子标签法(transposon tagging)将其克隆(Gray et al.，1997)。Lls1基因编码的蛋白含有两个芳环羟化双加氧酶特有的结构域，预测其功能是通过降解酚类化合物，从而抑制细胞死亡。

自70年代早期发现水稻中第一个假病斑突变体以来，在水稻中已发现了近百种类似的突变体。但真正用于鉴定，分子机理及功能研究的并不多。目前已进行突变体相关基因定位的只有10个左右，且大多数定位在传统的遗传图谱上。位于水稻第5染色体上的假病斑突变体基因spl7(spotted leaf 7)最近已被克隆(Yamanouchi，et al.，2002)，结构功能分析表明，spl7与已知的耐热转录因子hsf(heat stree transcription factor)具有很高的同源性。对野生型基因Spl7和突变基因spl7的碱基序列比较后发现，只有一个碱基的置换(G转变成了T)就导致了突变基因spl7功能的欠缺，使叶片产生了坏死斑。

假病斑突变体的研究表明，类病变坏死的机制很复杂，很多因素的变异都有引起细胞死亡的可能。首先抗性相关基因的突变可能造成假病斑坏死的发生。正常情况下只有当植物的抗病基因与病原物的无毒基因发生互作后，才会产生过敏性死亡。抗病相关基因功能的失调也会导致细胞死亡的发生(Hu et al，1996)。而更多的证据显示坏死突变的发生是由于信号传导途径中发生的突变(kliehenstein et al，1999)或正常的代谢途径失调(Hu et al，1998)造成的。另外，植物中存在的程序性细胞死亡(PCD)的失控也会造成细胞死亡的发生(Dangl，1996；Martiensen，1997)。活性氧或自由基的形成也是坏死突变形成的一个主要原因(Lambetal，1997；Machet al，2001)。

已经研究的植物PCD诱导剂包括无毒病原菌，病原菌培养基提取物，细胞壁制备物，非生物诱导剂如H₂O₂等。病原菌产生的植物毒性化合物，可以作为关键的毒性决定剂，也能导致宿主细胞死亡。腐生植物病原真菌合成了广泛的植物毒性化合物，包括由两种不相关的真菌产生的鞘氨醇类似物真菌毒素。一种是由番茄病原菌Alternaria alternata f.sp.Lycopersici(AAL)产生的AAL毒素，另一种是由玉米真菌病原菌Fusariummoniliforme产生的fumonisin B1(FB1)。FB1可能通过竞争性抑制神经酰胺合成酶-神经鞘脂生物合成的关键酶来诱发植物和动物组织培养细胞的程序性细胞死亡。神经鞘脂在多种细胞过程中发挥各种各样的作用：作为膜蛋白的锚和第二信使来调节各种细胞功能，包括分化、生长和凋亡。神经酰胺是哺乳动物胁迫途径的关键成分，能激活几种胁迫活化蛋白激酶和磷酸酶。到目前为止，植物对真菌毒素的抗性与解毒，亲和性改变或毒素靶的缺失有关。FB1作为一种PCD诱导剂对实验室具有非常大的吸引力，一是它能模拟病原菌侵染植物引起的细胞死亡，包括ROI的产生，酚类化合物沉积，植保素积累和PR基因的表达。二是因为高度纯化的FB1已经商业化了(Stone et al.，2000，Brandwagt et al.，2001)。

传统上进行蛋白细胞内定位发方法多是利用抗原抗体的特异性反应，用标记的抗体探测蛋白在细胞内的定位。用这种方法，细胞多事先需要固定，固定过程可能会引起人为的假像，不一定能真实反映出蛋白质在细胞内的定位情况。当要研究蛋白在体内的动态变化时，过去多是利用显微注射携带有荧光的特异标记物。这种方法存在实验步骤繁琐、花费时间长、操作难度大、只能观察细胞的特定发育时期等缺点。用GFP作为蛋白标记物则可以很好地解决上述问题，可以对蛋白质在细胞内的动态分布进行连续的活体观察。目前GFP在植物中有两个主要用途：在高分辨率下检测基因表达和蛋白质的定位，在活体植物中作为遗传标记。由于共聚焦显微镜的应用，在GFP标记的活体植物细胞中可进行细胞和亚细胞的分析以及动态检测。

从水母体内分离的绿色荧光蛋白(GFP)基因是1994年发现的一种新型报告基因，它只编码238个氨基酸，是目前唯一能在异源细胞内表达后自发产生荧光的蛋白，GFP的荧光发射峰在509nm，最大激发波长为395nm，在475nm有一肩峰，即吸收蓝光，发射绿光。GFP在各种条件下都很稳定，比如能在酸、碱或盐酸胍处理后，一旦恢复中性pH环境，或是除去变性剂，荧光即可恢复并具有和原来一致的发射光谱。用GFP标记蛋白质具有如下优点：1、GFP是一种稳定的、可溶性的蛋白，对光稳定；2、GFP的存在不影响融合蛋白的活性；3、标记效率高；4、GFP只需要用光激发，无需再加任何酶或底物，因而方便快速，且没有背景的干扰(岳莉莉等，1997)。

发明内容

本发明提供了一个水稻锌指蛋白基因，其编码一个含有143个氨基酸的蛋白。该蛋白含有三个锌指结构域，均具有CxxCxRxxLMYxxGASxVxCxxC序列，与拟南芥LSD1蛋白相似。同时构建了OsLSD1基因的三种植物表达载体pCOsLSD1-S，pCOsLSD1-A，pCOsLSD1-R。

Southern blot分析表明该基因为单拷贝基因。Northern blot分析表明OsLSD1基因受稻瘟病菌完全抑制。通过农杆菌介导转化水稻(Oryzasativa Nipponbare)，结果表明OsLSD1基因是植物程序性细胞死亡的负调控因子，并能促进转基因愈伤组织的生长分化。通过农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)，结果表明OsLSD1基因具有抗细胞死亡的功能。可以应用于植物基因工程。

附图说明

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

图1.水稻OsLSD1和拟南芥LSD1三个锌指结构域同源性比较。

CxxCxRxxLMYxxGASxVxCxxC是三个锌指结构域共同具有的氨基酸序列。

图2：水稻OsLSD1基因的基因组结构示意图，全长为2968bp的水稻OsLSD1基因由6个外显子和5个内含子组成，外显子，—：内含子，外显子下的数字表示其大小(bp)。

图3.水稻OsLSD1基因的southern blot分析。泳道1：1 kb DNA ladder；泳道2：水稻品种日本晴；泳道3：水稻品种IR24。

图4.水稻接种稻瘟病菌Mg103的Northern blot分析。hpi为接种后小时(hour post inoculate)的缩写，图中5个泳道分别表示接种0，4，8，24，48小时OsLSD1基因的表达情况。

图5A.pCOsLSD1-S植物表达载体图谱。

CaMV 35S：花椰菜病毒35S启动子

NOS POLY A：胭脂碱合成酶基因转录终止子

HYG(R)：潮酶素磷酸转移酶基因(具有潮酶素抗性)

Kan(R)：新霉素磷酸转移酶基因(具有卡那霉素抗性)

T-BORDER(L)：T-DNA左边界

T-BORDER(R)：T-DNA右边界

图5B.pCOsLSD1-A植物表达载体图谱。

图5C.pROK2植物表达载体图谱。

图5D.pCOsLSD1-R植物表达载体图谱。

图5E.pCOsGFP瞬时表达载体图谱。

图5F.pCOsGFP稳定表达载体图谱。

图6.转OsLSD1基因的水稻抗性愈伤在分化培养基上培养12天的图片。

图7.转pCOsLSD1-A的T₀代水稻植株，无菌培养叶片出现病斑的图片，箭头所示为病斑。

图8.转pCOsLSD1-A的T₁水稻植株，自然条件下叶片出现病斑的图片。

图9A.转基因水稻植株的潮霉素磷酸转移酶基因PCR检测。泳道1：DL-2000 DNA ladder；泳道2-9：pCOsLSD1-S转基因水稻植株；泳道10-15：pCOsLSD1-A转基因水稻植株；泳道16：pOsLSD1质粒阳性对照；泳道17：非转基因植株对照。

图9B.转基因水稻植株的OsLSD1基因PCR检测。泳道1：DL-2000DNA ladder；泳道2：pOsLSD1质粒阳性对照；泳道3：非转基因植株对照；泳道4-10：pCOsLSD1-S转基因水稻植株；泳道11-16：pCOsLSD1-A转基因水稻植株。

图10.转基因水稻植株的Southern blot分析。所用探针为OsLSD1基因片段，4.3kb杂交片段是水稻基因组本身具有的OsLSD1拷贝。泳道1：1 kb DNA ladder；S6，S8，S9：转pCOsLSD1-S水稻植株；T1，T2，T5，T6：转pCOsLSD1-A水稻植株；P1：转pCAMBIA1301水稻植株(对照)；NB：非转基因水稻(对照)。

图11.转基因水稻的Northern blot分析。所用探针为OsLSD1基因片段。S6，S8，S9：转pCOsLSD1-S水稻植株；T1，T2，T5，T6：转pCOsLSD1-A水稻植株；P1：转pCAMBIA1301水稻植株(对照)；NB：非转基因水稻(对照)。

图12：转基因烟草植株的PCR检测。泳道1：DL-2000 DNA ladder；泳道2-10：转pCOsLSD1-S烟草植株；泳道11-13：转pCAMBIA1301烟草植株；泳道14：pOsLSD1质粒阳性对照；泳道15：非转基因植株对照。

图13：转pCOsLSD1-S烟草在含有FB1培养基上生长三周的图片。

图14：OsLSD1-GFP融合蛋白在转基因烟草中的分布情况。

具体实施方式

下面通过具体的实施例并结合附图对本发明作进一步详细的描述。

实施例所用试剂及成分见表1。表1：所用试剂及成分

 NB₀N₆大量盐，B₅微量盐和B₅有机，300mg/L酪蛋白水解物，500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L phytagel，pH5.8 NBDNB₀培养基，2.0mg/L 2.4-D，pH5.8 AAMN₆培养基，2mg/L 2.4-D，1g/L酪蛋白水解物，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，100μM乙酰丁香酮，pH5.2 NAN₆培养基，2mg/L 2.4-D，1g/L酪蛋白水解物，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，100μM乙酰丁香酮，pH5.2 NBDHNBD，50mg/L潮霉素，250mg/L头孢霉素，200mg/L氨苄青霉素，pH5.8 NBPNB₀培养基，1.0mg/L 6-BA，2.0mg/L NAA，5.0mg/L ABA，50mg/L潮霉素，pH5.8 NBRNB₀培养基，2.0mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，1.0mg/L KT，1.0mg/L IAA，50mg/L潮霉素，pH5.8 1/2MS2.15g/L MS(GIBCO)，B₅有机，15g/L蔗糖，3.0g/Lphytagel，pH5.8 YEP10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，pH7.0分化培养基1/2MS，2mg/L 6-BA，0.1mg/L IAA，pH5.8生根培养基1/2MS，0.2mg/L IAA，pH5.8水稻基因组DNA提取缓冲液100mM Tris-Cl(pH8.0)；50mM EDTA(pH8.0)；500mMNaCl；1.25％ SDS；0.2％β-巯基乙醇烟草基因组DNA提取缓冲液100mM Tris-Cl(pH8.0)；5mM EDTA(pH8.0)；0.35M葡萄糖；2％PVP40；0.1％二乙基二硫氨基甲酸；0.2％β-巯基乙醇；0.5％Triton-X 100烟草基因组DNA裂解缓冲液100mM Tris-Cl(pH8.0)；5mM EDTA(pH8.0)；1.4MNaCl；2％CTAB；2％PVP40；0.1％二乙基二硫氨基甲酸；0.2％β-巯基乙醇实施例一OsLSD1 cDNA的获得及其基因组结构1.1水稻(Oryza sativa)cDNA文库的构建

cDNA文库所用材料为生长3周的水稻栽培品种C101A51(InterbationalRice Research Institute，IRRI)的叶片。根据SUPERSCRIPTTM Plasmid System(GIBCO BRL CAT.NO.18248-013)的说明书进行操作构建cDNA文库。具体实验过程如下：A.用TRI_ZOL试剂(GIBCO)提取总RNA，然后用oligo(dT)纤维素柱(QIAGEN)分离mRNA。B.取5μg mRNA，加入1μg含NotI位点的接头，在1000 units S_UPERS_CRIPT II逆转录酶作用下合成cDNA第一条链。C.用2 units RNase H除去mRNA链，由40 units大肠杆菌DNA聚合酶I合成cDNA第二链。D.在双链cDNA两端加上10μg含有SalI位点的接头，用60 units NotI限制性内切酶消化，回收cDNA片段，溶解在100μl TEN缓冲液中。E.除去小于500bp的片段，富集长的cDNA片段。F.将得到的cDNA片段连接到由NotI和SalI酶切的pSPORT1载体上。G.取2μl连接产物电转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH10B感受态细胞(GIBCO)，在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取单菌落，建成含有5×10⁶个克隆的cDNA文库。1.2 OsLSD1 cDNA的获得

随机挑选300个克隆测序(上海基康生物技术有限公司，DNA测序仪model 3700)，并将所得序列在NCBI(National Center for BiotechnologyInformation；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)网站上进行BLASTN比较分析，发现其中一个序列与拟南芥LSD1基因同源，命名为OsLSD1(Oryzasativa LSD1)，其核苷酸序列见SEQ ID NO：1，包含该序列的表达载体命名为pOsLSD1。测序结果表明该cDNA含有一个432bp的开放阅读框(ORF)，编码一个含有143个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：2)。该蛋白含有三个锌指结构域，与拟南芥LSD1蛋白同属于C-x-x-C型锌指结构。将该蛋白序列在NCBI网站上进行BLASTX比较分析，发现它与拟南芥LSD1蛋白同源性为59％。如图1所示，三个锌指结构域内部及其周围序列的同源性较高。含有OsLSD1 cDNA的大肠杆菌转化子pOsLSD1/DH10B已交由中国普通微生物保藏中心保藏，保藏登记号：CGMCC No.0884。2.OsLSD1的基因组结构分析2.1将OsLSD1的cDNA序列用BLASTN搜索水稻基因组序列库RGP(RiceGenome Program，Japan；http：//rgp.dna.affrc.gojp/cgi-bin/statusdb/status.pl)，发现OsLSD1基因位于水稻第8号染色体PAC克隆：P0672D01上，ORF对应的基因组区域长2968bp，由6个外显子和5个内含子组成，其结构示意图见图2。2.2 Southern blot分析

应用DNAMAN软件(Lynnon Biosoft)对已知的OsLSD1基因组序列进行限制性内切酶分析。在所用的cDNA探针覆盖的基因组区域内，没有HindIII位点，所以选择该酶对水稻基因组DNA进行切割。(1)水稻DNA的提取

水稻DNA提取按Dellaporta等(1984)所述方法进行，具体如下：A：用液氮研磨1-1.5克的水稻叶片，转至15ml离心管中。B：加入6ml预热到65℃的提取缓冲液(见表1)，置65℃水浴放置30分钟。C：加入2.25ml 5M KAc溶液，混匀，冰浴20分钟，4℃，4000rpm，离心20分钟，转移上清至另一个15ml离心管中。D：加入5ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒混匀，4℃，4000rpm，离心20分钟。E：转移上清至一新的15ml离心管中，加入5ml冰预冷的异丙醇，将DNA用钩子钩出，70％乙醇洗涤，晾干，溶于200μl(含20μg/ml RNAase A)TE中，-20℃保存备用。DNA的定量用紫外测定法，即1 OD₂₆₀＝50μg/ml或Agarose电泳后用EB染色比较确定。(2)水稻DNA的酶解和电泳

取2μg DNA加入15u的Hind III和2μl 10×限制性内切酶缓冲液，加无菌重蒸水至总体积为20μl，37℃保温过夜，在0.8％琼脂糖凝胶上以4V/cm电泳分离DNA。(3)DNA的转膜、引物标记及杂交反应均参照Sambrook等(1989)的方法进行。具体如下：

0.25N HCl变性15分钟，0.4N NaOH变性20分钟，用0.4N NaOH将DNA转移到Hybond-N⁺上。用Ready To Go DNA标记试剂盒对OsLSD1基因片段(296bp)进行α-³²P-dCTP标记后，用作Southern blot杂交探针，杂交液为church缓冲液(Sambrook等，1989)。

如图3所示，Southern blot分析表明，该基因为单拷贝。杂交条带约4.3kb，与预期的4286bp一致。2.3Nouthern blot分析

在25℃温室培养水稻C039(International Rice Research Institute，IRRI)，长至3周时用水稻稻瘟病菌Magnaporthe grisea 103(InternationalRice Research Institute，IRRI)接种。在28℃培养箱培养Mg103一周，用玻璃刮刀轻刮其表面，诱导孢子的产生。在光照下继续培养3-4天，以获得孢子。用含0.02％Tween20的蒸馏水将孢子洗下，制成浓度为1×10⁵孢子/毫升的悬液。用喷雾形式对水稻叶片进行表面接种，分别在接种0，4，8，24，48小时取样。

总RNA的提取用Trizol试剂(GIBCO)，按说明书操作。具体如下：1).取100mg水稻叶片，用液氮研磨直至粉状；2).加入1ml Trizol试剂，室温放置5分钟；3).4℃，12,000g离心10分钟；4).将上清转移到一新的1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置2-3分钟；5).4℃，12,000g离心15分钟；6).转移上清至一新的1.5ml离心管中，加入0.6ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；7).4℃，12,000g离心10分钟；8).除去上清，加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀，晾干后加入30μl超纯水以溶解RNA。Northern杂交按上述Southern杂交方法进行。每个泳道20μg总RNA，1％的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离，用20×SSC将RNA转移到Hybond-N⁺上。Northern杂交结果示于图4。表明OsLSD1基因受稻瘟病菌抑制。在接种稻瘟病菌4小时后表达被完全抑制，48小时后重新表达，且表达量比接种前有所提高。这一表达模式与植物(包括水稻)PR(pathogenesis related proteins)蛋白的表达模式相反，推测该基因是程序性细胞死亡的负调节子。从OsLSD1的结构和表达模式上，我们初步证明该基因是拟南芥LSD1基因的同源基因，在水稻抗病过敏反应和水稻细胞程序死亡上有重要意义。二OsLSD1基因表达载体的构建2.1 OsLSD1基因的sense，antisense植物表达载体的构建

根据OsLSD1基因的cDNA序列，设计如下两对引物：sense F：5′-CCCATGGTGCAAGCCAGATTACCAT-3′   (SEQ ID NO：3)sense R：5′-GGGTGACCTCATTTATTCCGCAGGCT-3′  (SEQ ID NO：4)anti F：5′-GGGTGACCGCATCTACAAGCGACGC-3′    (SEQ ID NO：5)anti R：5′-CCCATGGCATTTATTCCGCAGGCTC-3′    (SEQ ID NO：6)

在sense F和anti R的5’端各含有一个NcoI限制性酶切位点(斜体，下划线表示，下同)。在sense R和anti F的5’端各含有一个BstEII限制性酶切位点。寡核苷酸引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。以1ng的质粒pOsLSD1为扩增模板，在含有1×扩增缓冲液，1.5mM MgCl₂，0.2μmol/L扩增引物，0.2mmol/L dNTPs，0.5urTaq DNA聚合酶的20μl混合液中进行PCR扩增反应。扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸1分钟，循环36次，72℃延伸10分钟。PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳分析，检测到预期的758bp和645bp的扩增片段。将扩增产物用胶回收试剂盒(上海华舜生物公司)回收并连接到pGEM-Teasy vector(Promega)上。取2μl连接产物电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在含X-gal和IPTG的LB(含100μg/ml的氨苄青霉素)平板上培养。选取白色菌落，提取质粒、EcoRI酶切分析，确定为转化子后交于上海博亚生物公司测序。扩增产物与cDNA序列比对结果表明该扩增过程没有产生碱基突变。用NcoI和BstEII限制性内切酶酶解该转化子的质粒，并与用同样酶切的pCAMBIA1301植物表达载体(Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture，CAMBIA)的大片段连接，电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上培养，挑取单菌落，提取质粒，以NcoI和BstEII酶切分析后确定为转化子，分别命名为pCOsLSD1-S和pCOsLSD1-A，图谱示于图5A和5B。将这两个表达载体分别电转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，经卡那霉素筛选，NcoI和BstEII酶切分析证明其结构完全正确后用于植物转化。2.2 OsLSD1基因的RNA interferience(RNAi)植物表达载体的构建

根据OsLSD1基因的cDNA序列和GUS(葡糖醛酸糖苷酶)基因序列，设计如下三对引物：RiS F：5’-GGGTACCCTGTGCCATTTACACCTCCC-3’     (SEQ ID NO：7)RiS R：5’-CGAGCTCTGTGCACTCAAAGCATCGG-3’      (SEQ ID NO：8)RiA F：5’-CGGATCCCTGTGCCATTTACACCTCCC-3’     (SEQ ID NO：9)RiA R：5’-CTCTAGATGTGCACTCAAAGCATCGG-3’      (SEQ ID NO：10)GUSB F：5’-CGGATCCAGTGGCAGTGAAGGGCGAAC-3’(SEQ ID NO：11)GUSK R：5’-GGGTACCGGCTAGCTTGTTTGCCTCCC-3’(SEQ ID NO：12)

引物RiS F的5’端含有KpnI限制性酶切位点(斜体，下划线表示，下同)；引物RiS R的5’端含有SacI限制性酶切位点；引物RiA F的5’端含有BamHI限制性酶切位点；引物RiA R的5’端含有XbaI限制性酶切位点；引物GUSB F的5’端含有BamHI限制性酶切位点；引物GUSK R的5’端含有KpnI限制性酶切位点。引物RiS F，R和RiA F，R分别以质粒pOsLSD1为扩增模板，引物GUSB F和GUSK R以pCAMBIA1301为扩增模板，进行PCR扩增，反应条件同上。在0.8％的琼脂糖胶上电泳，检测到预期的461bp，461bp和977bp的扩增片段。将扩增产物用胶回收试剂盒(上海华舜生物公司)回收并连接到pGEM-Teasy vector上。取2μl连接产物电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在含X-gal和IPTG的LB(含100μg/μl的氨苄青霉素)平板上培养，选取白色菌落，经提取质粒、以EcoRI酶切分析，确定为转化子后交于上海生工生物工程公司测序。结果表明该扩增过程没有产生碱基突变。用相应的限制性内切酶酶解这三个转化子的质粒，胶回收插入片段，并与用SacI和XbaI酶切的pROK2载体(为本实验室构建，用XbaI和SacI消化pBI121植物表达载体(CLONTECH)，回收大片段，与用同样内切酶消化的pCAMBIA1301小片段即多克隆位点连接，所得载体结构示意图见图5C)的大片段在16℃连接过夜，电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上培养，挑取单菌落，经提取质粒，酶切分析后确定为转化子。用插入片段两端的EcoRI和HindIII酶切该重组质粒，胶回收3kb的片段，连接到用同样酶切的pCAMBIA1300植物表达载体上(Center forApplication of Molecular Biology to International Agriculture，CAMBIA)。经提取质粒，酶切分析后确定为转化子，命名为pCOsLSD1-R。将pCOsLSD1-R电转化到根癌农杆菌EHA105中，经卡那霉素筛选，相应限制性内切酶酶切分析证明其结构完全正确后，用于转基因植物的研究。构建好的载体结构见图5D。2.3 OsLSD1基因与GFP基因融合表达载体的构建

GFP作为报告基因广泛用于蛋白质定位研究。本研究所用的pGFP2质粒为改造过的植物表达载体质粒(左健儒先生惠赠，中国科学院遗传和发育研究所，Lee et al.，2000)，来源于pBI221，长4488bp，GFP基因位于CaMV 35S启动子和NOS终止序列之间。

根据OsLSD1基因序列和GFP基因序列，设计了如下一对引物，保证这两个基因的阅读框能够通读：eGOsL-F：5′-CCTCGAGATGCCGGTTCCCCTTGCT-3’       (SEQ ID NO：13)eGOsL-R：5′-GGGTACCGCTGCTGGGCTTCTGGTC-3’       (SEQ ID NO：14)

引物eGOsL-F 5’端含有XhoI限制性酶切位点，引物eGOsL-R 5’端含有KpnI限制性酶切位点。以OsLSD1基因为模板，PCR反应条件同上。回收429bp的PCR扩增产物(OsLSD1基因的ORF)，并连接到pGEM-Teasy vector上。取2μl连接产物电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在含X-gal和IPTG的LB(含100μg/ml的氨苄青霉素)平板上培养，选取白色菌落，提取质粒、EcoRI酶切分析，确定为转化子后，用XhoI和KpnI酶切该转化子的质粒，回收429bp的插入片段，连接到与用同样酶切的pGFP2载体大片段上，电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板上培养，挑取单菌落，经提取质粒、EcoRI酶切分析，确定为转化子，命名为pOsGFP，载体图谱示于图5E。该表达载体可用于瞬时表达研究。

以PstI和EcoRI酶切pOsGFP，胶回收含有CaMV 35S启动子，OsLSD1，GFP和Nos转录终止序列的片段，连接到用同样酶切的pCAMBIA1300植物表达载体上，构建成稳定表达载体pCOsGFP，载体图谱示于图5F。将pCOsGFP电转化到根癌农杆菌EHA105中，经卡那霉素筛选，限制性内切酶酶切分析证明其结构完全正确后，用于转基因植物的研究。

以上DNA的酶切、载体的制备、感受态细胞的制备、克隆的筛选、连接反应及细菌转化都按照Sambrook等(1989)所述方法进行。三转基因水稻的获得1水稻的转化1.1水稻愈伤组织的诱导

取日本晴Nipponbare成熟种子(International Rice Research Institute，IRRI)，脱去外壳。用70％的酒精处理90秒，20％次氯酸钠处理20分钟，再用0.1％的升汞处理15分钟。用无菌水冲洗3-4次，以无菌滤纸吸干表面水分。接种于含2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的NB₀培养基(NBD)中，25℃黑暗培养。7-10天后，取出水稻种子盾片上诱导出的愈伤组织，继代培养于相同的培养基中。25℃黑暗培养3周，即可长出旺盛生长的胚性愈伤组织。1.2农杆菌的预处理

分别挑取含双元载体质粒pCOsLSD1-S，pCOsLSD1-A，pCOsLSD1-R和pCAMBIA1301的农杆菌EHA105单菌落，接种于含10mg/L利福平，50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中。28℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.5。以1％接种量转接于含相同抗生素的YEP液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0。室温4000rpm离心20分钟，收集菌体。以等体积的AAM培养基重悬菌体，室温4000rpm离心20分钟，收集菌体。以AAM重悬菌体至OD₆₀₀＝0.5。1.3水稻胚性愈伤组织和农杆菌共培养

选取淡黄色旺盛生长的水稻愈伤组织，浸泡于上述处理的农杆菌中30分钟。以无菌滤纸吸干表面菌液，接种于NA培养基中，25℃黑暗培养3天。1.4水稻转化体的筛选和植株的再生

将在NA培养基中和农杆菌共培养了2-3天的愈伤组织，用无菌水洗15-20遍，转入含250mg/L头孢霉素，200mg/L氨苄青霉素的无菌水中，25℃下120rpm振荡培养两个小时。无菌滤纸吸干表面水分后，接种于含2.0mg/L 2，4-D，250mg/L头孢霉素，200mg/L氨苄青霉素和50mg/L潮霉素的NB₀培养基(NBDH)中。25℃黑暗培养15-20天。挑取潮霉素抗性愈伤组织，继代培养于相同的NB₀培养基中，25℃黑暗培养3周。将旺盛生长的潮霉素抗性愈伤组织转接于含1.0mg/L 6-BA，2.0mg/L NAA，5.0mg/L ABA和50mg/L潮霉素的NB₀培养基(NBP)中，25℃黑暗培养至出现白色致密的抗性愈伤组织。并将此愈伤组织转接于含2.0mg/L6-BA，1.0mg/L IAA，1.0mg/L NAA，1.0mg/L KT和50mg/L潮霉素的NB₀培养基(NBR)中。在25℃，2000lux光照16小时，黑暗8小时的条件下培养。切下再生芽接种于含0.1mg/L IBA的1/2MS固体培养基中，直至转化体长出完整的根系。将形成完整植株的转化体移入不含糖份和激素的1/2MS液体培养基中，在90％湿度的光照培养箱中，4000lux光照16小时，黑暗8小时的条件下培养7-10天，移植于温室中。

四种植物表达载体pCOsLSD1-S，pCOsLSD1-A，pCOsLSD1-R和对照pCAMBIA1301各获得了235，161，20和106株抗潮霉素的转基因水稻植株。2转基因水稻的分析2.1转基因水稻的表型分析

从开始分化到出苗，可以看出转pCOsLSD1-S，pCOsLSD1-A，pCOsLSD1-R植株与对照转pCAMBIA1301植株明显不同。在无菌培养条件下，转pCOsLSD1-S的抗性愈伤组织移至分化培养基上三天即变绿，而后三者一般需要6-10天，参见图6。转pCOsLSD1-S的植株出苗率为68.5％，明显高于转pCOsLSD1-A的46.1％，转pCOsLSD1-R的36％和转pCAMBIA1301的49.6％(见表2)。表2转基因水稻愈伤组织分化情况

    载体转基因植株数/  抗性愈伤数预分化愈伤开始出  现绿色天数  出苗率pCOsLSD1-S    235/343    3    68.5％pCOsLSD1-A    161/349    10    46.1％PCOsLSD1-R    21/55    10    38.2％pCAMBIA1301    106/213    7    49.6％

另外，T₀代转pCOsLSD1-A和pCOsLSD1-R植株长势很弱，根系不发达。将Northern blot检测(方法同上)OsLSD1基因大量表达的植株移栽到1升的大量筒中进行无菌培养。转pCOsLSD1-A的水稻叶片中部开始出现微小病斑，逐渐扩展，叶片卷曲，有些逐渐导致整株死亡，参见图7。T₁代植株在自然条件下叶片中部自发产生坏死斑，与无菌培养表型相似，参见图8。这与我们最初的推测相吻合，证明了OsLSD1基因与水稻程序性细胞死亡和转基因愈伤生长分化有关。2.2转基因水稻的PCR检测

分别随机选取8株转pCOsLSD1-S和6株转pCOsLSD1-A载体的水稻用于PCR检测，各取15ng的水稻基因组DNA作为扩增模板，在含有1×扩增缓冲液，0.2μmol/L扩增引物，0.2mmol/L dNTPs，0.5urTaq DNA聚合酶的PCR反应混合液中进行PCR扩增反应：潮霉素基因的扩增引物：HA：5’-TGCGCCCAAGCTGCATCAT-3’            (SEQ ID NO：15)HB：5’-TGAACTCACCGCGACGTCTGT-3’          (SEQ ID NO：16)OsLSD1基因的扩增引物：OsLSD 1-F：5’-CGCAGTTTGCAGTACCGTGAC-3’   (SEQ ID NO：17)OsLSD1-R：5’-AGCTGCTGGGCTTCTGGTCTA-3’    (SEQ ID NO：18)

预期扩增片段大小分别为：858bp和296bp。扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸1分钟，循环36次后，72℃延伸10分钟。PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。潮霉素基因的扩增结果表明100％的转基因水稻为PCR阳性，即产生了特异性的858bp的扩增靶DNA条带，阳性对照pCAMBIA1301质粒扩增出相同的条带，而未加任何模板的阴性对照没有扩出条带。电泳结果见图9A，表明载体的潮霉素基因已整合到所检测的转基因水稻的染色体上。以OsLSD1基因引物扩增上述样品中的13个，均扩增到了预期的296 bp片段，初步证明OsLSD1基因已整合到水稻基因组中。电泳结果见图9B。2.3 Southern杂交分析

对PCR阳性植株进行Southern blot杂交，水稻DNA的提取、酶解、转膜、引物标记及杂交反应均参照上述方法进行。所用探针为OsLSD1基因片段(296bp)。结果示于图10，表明OsLSD1基因以单拷贝，2个或3个拷贝等方式整合到水稻染色体中。在4.3kb处每条泳道都有的一条杂交带为水稻本身带有的一个OsLSD1拷贝。2.4Northern杂交分析

以OsLSD1基因的双链DNA片段为探针，对部分T0代转基因水稻的Northern杂交(方法同上)结果见图11。在所检测的3个转pCOsLSD1-S植株中有1个为外源OsLSD1基因大量表达；检测的4个转pCOsLSD1-A植株中有3个为OsLSD1基因反义RNA大量表达的；而对照包括仅含有pCAMBIA1301载体的二株水稻和非转基因水稻品种日本晴只有微弱的组成型表达。四转基因烟草的获得和PCD诱导剂FB1对其影响的分析1.烟草的转化

通过叶盘转化法(Horch et al.，1985)，以根癌农杆菌EHA105为介导，将以上构建的pCOsLSD1-S和对照pCAMBIA1301中的T-DNA转化到烟草Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1(Tobacco Collection)基因组中。方法如下：将烟草叶片切成约1平方厘米的小块，与OD₆₀₀＝0.8-1.0的含目的载体的农杆菌共培养10分钟，无菌滤纸吸干表面菌液后转移到1/2MS培养基上，25℃暗培养2天。转移到分化培养基(含500μg/ml羧苄青霉素和20μg/ml潮霉素)上，在25℃，2000lux光照16小时，黑暗8小时的条件下培养约一个月，每15天更换一次培养基。将分化出的小苗转移到生根培养基上，继续培养约一个月。分别获得了9株转pCOsLSD1-S和3株转pCAMBIA1301的烟草植株。2转化再生植株的PCR检测

烟草DNA提取按李太元等(1994)所述方法进行，具体过程如下：A：取1g叶片擦拭干净，置于研钵中，液氮研磨直至面粉状；B：加入15ml提取缓冲液(见表1)，4℃，8,000rpm离心15min，弃上清，留沉淀；C：每个离心管中加入15ml裂解缓冲液(见表1)，重悬沉淀，55℃水浴30min；D：加入0.8倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，4℃，8,000rpm离心15min，取上清；E：加入10μl RNase(100mg/ml)，37℃或室温30min；F：加入0.8倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，4℃，8,000rpm离心15min，取上清；G：加入两倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀20min；H：4℃，8,000rpm离心15min，弃上清；I：加入5ml的70％乙醇洗涤，晾干，溶解在200μlTE中，-20℃保存备用。

取15ng的烟草基因组DNA作为扩增模板，在含有1×扩增缓冲液，0.2μmol/L扩增引物，0.2mmol/L dNTPs，0.5urTaq DNA聚合酶的20μl混合液中进行PCR扩增反应，所用引物为OsLSD1基因引物OsLSD1-F和OsLSD1-R。转基因烟草的PCR检测结果见图12，初步表明OsLSD1基因已整合到所检测的9株转OsLSD1和3株转pCAMBIA1301烟草的染色体上。3.FB1对转基因烟草的影响及分析

将转基因烟草的T₀代种子在1/2MS培养基(含有20μg/ml潮霉素)上进行无菌培养，一周后转移到新的1/2MS培养基上(含有20μg/ml潮霉素和2μMF B1)。FB1对烟草幼苗的根、茎、叶生长有明显的抑制作用，与文献报道一致(Stone et al.，2000)。转pCOsLSD1-S的烟草苗在二周后表现出与转pCAMBIA1301烟草苗的不同。转pCAMBIA1301的对照几乎不能在含2μM FB1的1/2MS培养基上生长，没有或只有微弱的侧根发生，看不到根毛。转pCOsLSD1-S的烟草的根分布有明显的根毛，且开始发出侧根，幼苗生长较快，见图13。从图13可以看出OsLSD1转基因烟草对细胞死亡诱导剂有明显的耐受性，表明OsLSD1基因具有抗细胞死亡的功能。五 OsLSD1基因的蛋白质定位分析

用上述的农杆菌介导的叶盘转化法获得32株转pCOsGFP烟草，取其根尖制成切片，激光共聚焦扫描显微镜(Bio-Rad MRC 1024)采集图像，激光光源为氩-氪激光(Krypton-Argonm)，激发光波长为488nm，图像采集用Lasershap软件(Bio-Rad)进行，图像处理用Confocal Assitant和Adobe Photoshop 6.0软件(Bio-Rad)进行。结果表明OsLSD1基因的蛋白产物分布在细胞核，见图14，与推测的OsLSD1基因是转录调节因子相一致。

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        20                  25                  30Leu Leu Met Tyr Pro Ala Gly Ala Thr Ser Val Cys Cys Ala Val Cys

    35                  40                  45Ser Thr Val Thr Ala Val Pro Ala Pro Gly Thr Glu Met Ala Gln Leu

50                  55                  60Val Cys Gly Gly Cys His Thr Leu Leu Met Tyr Ile Arg Gly Ala Thr65                  70                  75                  80Ser Val Gln Cys Ser Cys Cys His Thr Val Asn Leu Ala Met Glu Ala

            85                  90                  95Asn Gln Val Ala His Val Asn Cys Gly Asn Cys Arg Met Leu Leu Met

        100                 105                 110Tyr Gln Tyr Gly Ala Arg Ser Val Lys Cys Ala Val Cys Asn Phe Val

    115                 120                 125Thr Ser Val Gly Ala Ser Pro Gly Thr Asp Gln Lys Pro Ser Ser

130                 135                 140<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3cccatggtgc aagccagatt accat                                               25<210> 4<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>4gggtgacctc atttattccg caggct                                              26<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5gggtgaccgc atctacaagc gacgc                                               25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6cccatggcat ttattccgca ggctc                                               25<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>7gggtaccctg tgccatttac acctccc                                             27<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>8cgagctctgt gcactcaaag catcgg                                              26<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>9cggatccctg tgccatttac acctccc                                             27<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>10ctctagatgt gcactcaaag catcgg                                              26<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>11cggatccagt ggcagtgaag ggcgaac                                             27<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>12gggtaccggc tagcttgttt gcctccc                                             27<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>13cctcgagatg ccggttcccc ttgct                                               25<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>14gggtaccgct gctgggcttc tggtc                                               25<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>15tgcgcccaag ctgcatcat                                                      19<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16tgaactcacc gcgacgtctg t                                                   21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>17cgcagtttgc agtaccgtga c                                                   21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>18agctgctggg cttctggtct a                                                   21