不同潮气量机械通气对COPD大鼠肺脏氧化应激反应的影响

摘要

目的：慢性阻塞性肺疾病(Chronie obstructive pulmonary disease,COPD)是一种呈慢性进展,以通气功能受限且不完全可逆为特点,伴有肺功能逐渐下降的肺疾病。由于吸烟和环境污染,COPD患者数量剧增,全球40岁以上男性中10％患有COPD。在发展中国家预测COPD发病率和病死率未来几十年会迅速增长。氧化应激(Oxidative stress,OS)在COPD的病程进展中有重要意义。氧化应激是指细胞内活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)增加超出了抗氧化物质的清除能力,导致氧化应激/抗氧化应激的失衡,从而导致细胞结构破坏及功能受损,甚至死亡。ROS可以直接损伤细胞内蛋白质、脂类和DNA,细胞膜脂类受到氧化应激损伤后产生丙二醛(malondialdehyde,MDA),MDA是细胞受到氧化应激最早的产物,可以作为评价氧化应激的指标。红系衍生的核因子相关因子2(nuclear factor E2-related factor2,Nrl2),是一种转录调节因子。Nrf2通过抗氧化应激反应元件(antioxidant response element,ARE)调节细胞蛋白的表达,在肺脏疾病中发挥保护作用。在动物模型和吸烟的COPD患者实验中都已经证实了Nrf2抗氧化应激和抗炎的作用。谷胱甘肽(GSH)是体内维持细胞内氧化还原稳态重要抗氧化应激物质,其合成限速酶是谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL),GCL全酶可以分成催化亚基(GCLC)和调节亚基(GCLM),GCLM通过降低GCL催化反应的米氏常数(Km)及阻止GSH的反馈抑制影响着GCL全酶的效率,对GSH的合成及细胞的抗氧化应激具有重要意义。机械通气是重症COPD患者及全麻期间维持生命的重要措施,Chiumello等在研究机械通气对ALI/ARDS患者的肺损伤中发现,跨肺压和潮气量与功能残气量的比值过高这两种因素比大潮气量带来的肺损伤更严重。COPD患者小气道进行性狭窄、重塑,潮气量减小,气道阻力升高,肺实质破坏形成肺气肿,因此顺应性下降,功能残气量升高,与正常肺脏不同,跨肺压和潮气量与功能残气量比值都下降,因而,机械通气对COPD患者肺组织的影响可能与正常人存在不同。目前,有关不同潮气量机械通气对COPD肺组织氧化应激的影响还知之甚少。我们首先采用两次气管内滴入脂多糖和被动吸烟法建立COPD大鼠模型,然后采用不同的潮气量机械通气,观察不同潮气量对正常肺组织和COPD肺组织氧化应激反应以及抗氧化应激反应的影响。
　　 方法：雄性清洁级成年Wistar大鼠80只,平均体重220～20g。随机分为C、C1、C2、C3、M、M1、M2、M3八个组,每组1O只。C、C1、C2、C3组为正常大鼠,M、M1、M2、M3为COPD模型大鼠。C组为对照组,C1组为正常大鼠小潮气量机械通气组(VT=8ml/kg)、C2组为正常大鼠中潮气量机械通气组(VT=20ml/kg)、C3为组正常大鼠大潮气量机械通气组(VT=42ml/kg)。M组为COPD模型组,M1组为COPD模型组小潮气量机械通气组(VT=8ml/kg、M2组COPD大鼠中潮气量机械通气组(VT=20ml/kg)、M3组COPD大鼠大潮气量机械通气组(VT=42ml/kg)。通过两次气管内滴入脂多糖和被动吸烟法建立COPD大鼠模型,建模前、后称量每只大鼠的体重。建模后,检测大鼠肺功能呼吸频率f、潮气量VT、最大呼气流速pEF、第0.3秒用力呼气容积FEV0.3、第0.3秒用力呼气容积占用力呼气容积的百分比FEV0.3/FVC%、气道阻力RI和动态肺顺应性Cdyn,C组和M组做动脉血气分析。然后按上述分组采用不同潮气量机械通气2h,通气结束后留取肺组织,检测肺组织丙二醛(MDA)值,湿干比值(W/D),苏木素-伊红(HE)染色观察肺脏组织结构变化,逆转录-聚合酶反应(RT-pCR)方法检测Nrf2和GCLM mRNA的表达,Western blot方法检测Nrf2和GCLM蛋白的表达。免疫组化检测GCLM蛋白的表达。统计学分析所有结果用SpSS17.0软件系统进行统计分析。数据以均数±标准差(－χ±s)表示。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,显著性检验水准取a=0.05,p＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：⑴正常组和COPD模型组建模前后体重、肺功能及动脉血气分析。建模前正常大鼠组体重(218.66±14.71)g和模型大鼠组体重(223.58±15.63)g差异无统计学意义(P＞0.05),建模后正常大鼠组体重(344.88±12.77)g高于模型大鼠组(304.50±11.31)g,差异有统计学意义(P＜0.05),建模前后正常大鼠组体重增加量(126.22±21.43)g多于模型大鼠组(80.91±19.18)g,差异有统计学意义(P＜0.05)。COPD模型组大鼠VT、PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC%和Cdyn的值[(1.75±0.29)ml、(20.17±3.53)ml/s、(2.67±0.76)ml、(63.66±7.45)和(0.14±0.03)mL/cmH2O]较正常大鼠对照组[(3.13±0.67)ml、(41.21±7.66)ml/s、(4.89±0.83)ml、(86.94±6.56)和(0.38±0.05)mL/cmH2O]明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。CODP模型组大鼠f和RI[(151±28)次/min、(0.69±0.02)cmH2O/ml/s]较正常组[(110±31)次/min、(0.364±0.03)cmH2O/ml/s]升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。COPD模型组PaO2(72.0±7.1)mmHg较正常组(94.5±4.0)mmHg降低,PaCO2(42.5±1.9)mmHg较正常组(37.4±1.2)mmHg升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。⑵肺组织结构改变。M组光镜下肺组织病理改变符合COPD的特征性改变。正常大鼠组随着潮气量增加,肺脏结构损伤越严重。COPD大鼠组随着潮气量增加,损伤也愈严重,但COPD组中潮气量组损伤轻于正常大鼠中潮气量组,大潮气量损伤较正常大鼠大潮气量组严重。⑶肺组织W/D值。M组(4.474±0.01)高于C组(4.27±0.03),差异有统计学意义(P＜0.05)。C1组、C2组、C3组分别为[(4.45±0.04)、(4.75±0.04)、(5.00±0.06)]与C组(4.27±0.03)相比显著升高,差异均有统计学意义(P＜0.05)。C2组(4.75±0.04)高于C1组(4.45±0.04),C3组(5.00±0.06)高于C2组(4.75±0.04),差异均有统计学意义(P＜0.05)。M1组(4.48±0.01)与M组(4.47±0.01)相比差异无统计学意义(P＞0.05)、M2组(4.82±0.03)、M3组(7.01±0.01)较M1组(4.48±0.01)升高,M3组(7.01±0.01)高于M2组(4.824±0.03),差异均有统计学意义(P＜0.05)。⑷肺组织MDA值。M组大鼠肺组织MDA值(18.30±2.32)nmol/mg·protein与C组大鼠比较(8.74±1.22)nmol/mg·protein升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。C1组、C2组、C3组MDA值分别为[(10.77±1.50)nmol/mg·protein、(15.84±1.11)nmol/mg·protein(33.704±1.20)nmoi/mg·protein]较C组(8.74±1.22)nmol/mg·protein升高。C2组高于C1组,C3组高于C2组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。M1组MDA值(18.65±2.05)nmol/mg。Protein、M2组MDA值(19.54±2.17)nmol/mg·protein与M组(18.30±2.32)nmol/mg·protein比较升高,但差异无统计学意义(P＞0.05)。M3组MDA值(25.544±2.01)nmol/mg·protein较M2组(19.54±2.17)nmol/mg·protein升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。⑸肺组织Nrf2和GCLM mRNA水平。M组Nrf2和GCLM mRNA较C组表达明显升高(P＜0.05)。C2组、C3组与C1组、C组相比显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。C2组高于C1组,C3组高于C2组,差异有统计学意义(P＜0.05),C1组与C组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。M1组、M2组、M3组较M组明显升高.M2组高于M1组和M3组,差异有统计学意义(P＜0.05)。⑹肺组织Nrf2和GCLM蛋白水平。M组Nrf2和GCIM蛋白表达较C组表达明显升高(P＜0.05)。C2组、C3组与C组相比显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。C2组高于C1组,C3组高于C2组,差异有统计学意义(P＜0.05),C1组与C组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。M1组、M2组、M3组较M组明显升高,M2组高于M1组和M3组,差异有统计学意义(P＜0.05)。⑺肺组织GCLM蛋白免疫组化染色。GCLM蛋白主要表达与支气管肺泡上皮细胞。M组表达强于C组,C1组与C组比较差异无统计学意义(P＞0.05),C2组、C3组与C组相比表达增强,差异有统计学意义(P＜0.05)。C2组强于C1组,C3组强于C2组,差异有统计学意义(P＜0.05)。M1组、M2组、M3组较M组表达明显增强,M2组强于M1组、M3组,差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论：①小潮气量(8ml/kg)机械通气2小时对COPD大鼠肺组织的氧化应激无明显影响。抗氧化应激能力稍微增强。②中潮气量(20ml/kg)机械通气2小时对COPD大鼠肺组织的氧化应激无明显影响,抗氧化应激能力明显增强。③大潮气量(42ml/kg)机械通气2小时使COPD大鼠肺组织的氧化应激明显升高,抗氧化应激能力却有所下降。