慢病毒介导的Bcl-2基因RNAi联合TRAIL基因共表达对淋巴瘤细胞生长作用研究

摘要

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosisinducing legand,TRAIL)是近年发现的具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有毒性的肿瘤坏死因子家族成员。TRAIL可与胞膜死亡受体DR4、DR5结合来激活死亡受体通路,继而通过线粒体通路和非线粒体通路引起肿瘤细胞凋亡。
　　 以TRAIL为基础的肿瘤治疗策略已应用于临床试验,越来越多证据表明TRAIL在肿瘤治疗方面具有很大潜力和诸多优势。但单独应用TRAIL治疗血液系统肿瘤存在一定局限性,因为在血液系统恶性肿瘤中,常常因P53基因突变和B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)基因的高表达等因素,导致肿瘤细胞对TRAIL敏感性下降,并诱导血液系统恶性肿瘤对TRAIL的耐药。Bcl-2基因最初是在非霍奇金滤泡状B细胞淋巴瘤中分离出来的,是Bcl-2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子,主要分布在淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、肠癌、前列腺癌、白血病等恶性肿瘤中,通过与Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成异源二聚体,维持促凋亡成员在细胞内的定位分布,保护细胞不进入凋亡程序。
　　 我们猜想TRAIL的高表达和Bcl-2低表达可能对于抑制肿瘤细胞生长具有协同作用。首先,TRAIL和Bcl-2在肿瘤细胞凋亡途径的机制不同,TRAIL能够结合细胞表面的死亡受体,激活外源性途径进而激活Caspase-8,剪切BH3结构域凋亡诱导蛋白(Bcl-2 homology3 interacting domain death protein,BID),增强线粒体途径细胞凋亡信号;Bcl-2蛋白导致线粒体膜电位的丢失和通透性增加,从而引起细胞凋亡。另外,许多研究已经证明肿瘤细胞对化疗药物和放疗的耐药性与Bcl-2高表达有关,同时,Bcl-2的表达下调可以增加肿瘤细胞对药物凋亡诱导的敏感性。
　　 近年来慢病毒载体己成为转基因操作中重要的工具,它具有转移基因容量大、转导效率高以及可将外源基因整合至靶细胞基因组实现外源基因持续稳定表达等特点,已被广泛应用于包括淋巴瘤在内的多种肿瘤的研究。
　　 因此,本课题利用慢病毒载体和:RNAi技术,构建了同时高表达外源基因和shRNA表达盒的重组慢病毒载体,实现了对TRAIL,和Bcl-2基因的同步调控;同时还评价了所构建的重组慢病毒系统感染不同来源(NK细胞、B细胞和T细胞)淋巴瘤细胞的效率,鉴定了对TRAIL和Bcl-2基因的调控能力。通过对淋巴瘤细胞生长抑制、凋亡诱导作用以及旁观者效应的研究,深入探讨了TRAlL和Bcl-2基因对淋巴瘤细胞的生长作用以及协同抗肿瘤效应,探索了淋巴瘤治疗新模式。
　　 实验目的:
　　 构建共表达Bcl-2-shRNA和TRAIL基因的慢病毒载体系统,评价重组慢病毒系统对不同来源淋巴瘤细胞的感染效率,鉴定此重组慢病毒系统下调Bcl-2基因和上调TRAIL基因表达的功能。
　　 研究慢病毒介导的Bcl-2基因RNAi联合TRAIL基因表达对于淋巴瘤细胞生长抑制、凋亡诱导作用,评价Bcl-2基因表达下调和TRAIL表达上调抗淋巴瘤生长的协同效应,探索携带TRAIL基因和Bcl-2 shRNA的重组慢病毒对淋巴瘤细胞的旁观者效应。
　　 主要内容:
　　 第一部分:慢病毒表达载体pWPI-trail/bcl-2-shRNA的构建
　　 方法:
　　 1.将bcl-2-shRNA寡核苷酸片段退火,产物插入pLL3.7慢病毒表达载体mU6启动子下游,筛选阳性菌落,构建pll-bcl-2-shRNA慢病毒表达载体。
　　 2.提取人胎盘组织总RNA,RT-PCR扩增TRAIL cDNA,克隆至pGM-T克隆载体,筛选阳性菌落,酶切及测序鉴定pGM-T-trail的构建;将TRAIL基因从pGM-T-trail克隆载体上切下,并克隆至pWPI慢病毒表达载体EF-1α启动子下游(IRES-GFP上游),筛选阳性菌落,构建pWPI-trail慢病毒表达载体。
　　 3.从pll-bcl-2-shRNA质粒上获取mU6/bcl-2-shRNA表达盒,克隆至pWPI-trail质粒EF1-α启动子上游,筛选阳性菌落,构建pWPI-trail/bcl-2-shRNA慢病毒表达载体。
　　 结果:
　　 1.酶切鉴定及测序显示pll-bcl-2-shRNA慢病毒表达载体构建成功。
　　 2.酶切鉴定及测序显示pGM-T-trail构建成功;酶切鉴定显示pWPI-trail慢病毒表达载体构建成功。
　　 3.酶切鉴定显示pWPI-trail/bcl-2-shRNA慢病毒表达载体构建成功。
　　 第二部分:重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA的制备和感染淋巴瘤细胞效率测定
　　 方法:
　　 1.使用pWPI(pLL3.7)/vsvg/68.0慢病毒包装系统,在293T细胞中包装慢病毒lenti-bcl-2-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA,将粗提液用超速离心法浓缩纯化;利用绿色荧光蛋白(GFP)表达测定慢病毒滴度。
　　 2.利用荧光计数和流式细胞仪测定重组慢病毒lenti-bcl-2-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA对不同淋巴瘤细胞(人滤泡B淋巴瘤细胞系DOHH2,人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat和人NK细胞淋巴瘤细胞系YTS)的感染效率,评价不同淋巴瘤细胞株对慢病毒的敏感性。
　　 结果:
　　 1.成功包装出三种重组慢病毒lenti-bcl-2-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA,纯化浓缩后的滴度可达109IFU/ml。
　　 2.重组慢病毒lenti-bcl-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA可有效感染淋巴瘤细胞株,感染滴度较小时(MOI≤10),重组慢病毒对不同淋巴瘤细胞感染效率无明显差别(P＞0.05),但在感染滴度较大时(MOI＞10),重组慢病毒对YTS细胞的感染效率较其他两种细胞高(P＜0.05),但对于三种淋巴瘤细胞,重组慢病毒的感染效率最终进入平台期,部分淋巴瘤细胞始终不能被有效感染。
　　 第三部分:重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA功能测定和抗淋巴瘤生长作用研究
　　 方法:
　　 1.重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA感染淋巴瘤细胞(人滤泡B淋巴瘤细胞系DOHH2,人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat和人NK细胞淋巴瘤细胞系YTS),RT-PCR测定Bcl-2和TRAIL mRNA表达情况,Westernblot测定Bcl-2和TRAIL蛋白表达情况。
　　 2.MTT法测定重组慢病毒lenti-bcl-2-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA对于不同淋巴瘤细胞的生长抑制作用,评价bcl-2-shRNA和TRAIL的协同抗淋巴瘤生长作用。
　　 3.采用Flow cytometry(FCM)检测重组慢病毒lenti-bcl-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2-shRNA对人淋巴瘤细胞周期和凋亡率的影响;评价重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA对淋巴瘤细胞的旁观者效应。
　　 结果:
　　 1.lenti-trail/bcl-2-shRNA可以同时有效抑制Bcl-2基因表达和上调TRAIL基因的表达。
　　 2.重组慢病毒lenti-bcl-2-shRNA、lenti-trail和lenti-trail/bcl-2.shRNA可以有效抑制不同来源淋巴瘤细胞的增殖,诱导其凋亡,从而有效抑制淋巴瘤细胞的生长,其中以lenti-trail/bcl-2-shRNA的抗淋巴瘤作用最明显,表明bcl-2的下调和TRAIL的上调具有很好的协同抗淋巴瘤生长作用。
　　 3.重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA感染不同来源淋巴瘤细胞后可以产生明显的旁观者效应,即效应细胞和旁观细胞同时被抑制增殖和诱导凋亡,提示lenti-trail/bcl-2-shRNA有可能成为联合化疗药物以及其他抗肿瘤药物的理想基因药物。
　　 结论:
　　 1.成功构建同时携带TRAIL基因和bcl-2-shRNA的慢病毒表达载体pWPI-trail/bcl-2-shRNA,并可作为构建携带双靶点和报告基因的慢病毒载体平台。
　　 2.成功制备高滴度的重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA,可以不同程度的有效感染不同来源的淋巴瘤细胞。
　　 3.重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA的可以显著提高淋巴瘤细胞中TRAIL基因的表达和抑制Bcl-2基因的表达,且具有良好的协同作用,从而有效抑制淋巴瘤细胞的生长。
　　 4.重组慢病毒lenti-trail/bcl-2-shRNA感染不同来源淋巴瘤细胞后可以产生明显的旁观者效应。