慢病毒载体介导的RNAi靶向沉默HSP70基因对淋巴瘤细胞凋亡的影响

摘要

本文分析了慢病毒载体介导的RNAi靶向沉默HSP70基因对淋巴瘤细胞凋亡的影响。本研究分为两个部分：
　　 第一部分：慢病毒载体介导绿色荧光蛋白对淋巴瘤细胞株转染效率的优化研究。
　　 目的：观察淋巴瘤细胞株中慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转移的效率，通过观察不同转染条件下慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白转染效率实现对其转染条件的优化，为进一步研究慢病毒载体介导的RNA干扰在淋巴瘤细胞中的应用提供基本条件。
　　 方法：首先设计并合成带绿色荧光蛋白的慢病毒载体颗粒，按细胞株（人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji、人弥漫大B淋巴瘤细胞株Ly8和人套细胞淋巴瘤细胞株Sp53)、感染复数（MOI=1、10、30、50、60及100）、促转染试剂(Polybrene和Enhanced Infection Solution)、转染条件（离心和不离心）分组进行转染，然后在不同的时间点荧光显微镜下观察淋巴瘤细胞的绿色荧光蛋白表达情况，通过计算绿色荧光蛋白表达的细胞比率，明确各转染条件下的转染效率,对人弥漫大B淋巴瘤细胞株Ly8进行转染后传代培养，4周后流式细胞仪分析携带绿色荧光蛋白细胞的比率。
　　 结果：⑴细胞株，感染复数，促转染试剂，转染条件均对细胞的转染效率有影响，Sp53细胞株的转染效率大于Ly8细胞株，它们的转染效率均大于Raji细胞株；感染复数越大，细胞转染效率越高，当达到一定极限后，转染效率不随感染复数的增加而增加；Polybrene的促转染效果大于Enhanced Infection Solution;对悬浮细胞来说，离心的转染效率优于不离心的转染效率，其结果均有统计学意义(P＜0.05)。在人套细胞淋巴瘤细胞株Sp53中，感染复数为60，使用Polybrene为促转染试剂时，转染效率最高可达90％。⑵慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染入淋巴瘤细胞株后可稳定传代4周，4周后其转染效率仍可达85.6％。
　　 结论：①慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白对淋巴瘤细胞的转染效率在人套细胞淋巴瘤细胞株Sp53中，感染复数为60，使用Polybrene为促转染试剂时，转染效率最高可达90％。②慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白对淋巴瘤细胞株的转染可稳定的传代。
　　 第二部分：RNA干扰靶向沉默HSP70基因对套细胞淋巴瘤细胞凋亡的影响。
　　 目的：观察靶向沉默HSP70基因对套细胞淋巴瘤细胞株Sp53细胞生物学特性的影响，探讨HSP70基因对套细胞淋巴瘤凋亡途径的影响，为套细胞淋巴瘤的治疗提供新的思路。
　　 方法：首先设计并构建针对HSP70基因的慢病毒干扰载体，然后按论文一所得出的最优转染条件对套细胞淋巴瘤细胞株Sp53进行转染，采用Western blot法检测转染前后Sp53细胞中HSP70蛋白表达的变化。采用Annexin-V-PE荧光染料检测靶向干扰HSP70基因对套细胞淋巴瘤细胞株Sp53凋亡的影响。
　　 结果：⑴HSP70慢病毒载体颗粒转染套细胞淋巴瘤细胞株Sp53后240小时，收集细胞进行Western blot，结果表明，与空白Sp53组和阴性对照Sp53组相比，转染HSP70慢病毒颗粒的细胞HSP70的表达显著降低(P＜0.05)。这表明，设计合成针对HSP70的慢病毒载体颗粒可以在转录后水平抑制HSP70基因的表达。⑵慢病毒颗粒转染Sp53细胞后240小时，用PE标记的Annexin-V-抗特异性结合凋亡细胞，荧光显微镜下观察PE阳性细胞比率，即得到细胞凋亡率。结果表明，与空白Sp53组和阴性对照Sp53组相比，转染HSP70慢病毒颗粒的细胞的凋亡率明显增加(P＜0.05)。
　　 结论：①特异性靶向干扰HSP70基因的慢病毒载体能在蛋白水平上显著抑制HSP70蛋白的表达。②RNA干扰靶向沉默HSP70基因能促进Sp53细胞的凋亡。