家兔和人卵巢组织冷冻复苏及异种移植的实验研究

摘要

近年来，随着社会的发展，生活水平的提高，人们对自身健康及生殖质量日益关注，对生殖能力的保存提出了越来越高的要求，由此极大地促进了学者们对人类卵巢组织冻存技术的研究和临床应用的探索。2008年，WHO调查发现140万例新增肿瘤患者中近70万是女性，＜40岁育龄妇女占8％。放、化疗及手术等治疗有效地治疗了患者的疾病并延长了生命，但大剂量放疗、化疗和卵巢手术可导致年轻女性生殖力的丧失。保存女性生殖能力的方法有:取卵并行体外受精后胚胎冷冻、取卵后卵子冷冻、卵巢组织冷冻。因胚胎冷冻及卵子冷冻需要进行促排卵、取卵等较长周期的治疗，影响和延误恶性肿瘤患者的治疗，且只适用于已婚女性，因此应用受到限制。而卵巢组织冷冻保存不需要对卵巢进行药物刺激促排卵，在手术及化疗前直接切除卵巢组织进行冷冻，不影响患者自身原有恶性肿瘤及疾病的化疗及放疗，对女性生育储备的生殖内分泌功能保存有着重要的意义，为此类患者提供了一种补偿方法。20世纪50年代初，Parkes将大鼠卵巢组织切片慢速冷冻保存于-79℃的甘油盐水混合液中，快速解冻复苏后自体移植，之后观察到移植的卵巢组织出现卵泡生长发育，大鼠恢复了内分泌功能。20世纪90年代，卵巢组织冷冻随着冷冻科学技术的发展和改进以及各种抗冻剂的出现，发展非常迅速，不断有小鼠、绵羊和非人类哺乳类动物卵巢组织冷冻实验研究报道，并有冻融卵巢组织移植成功的案例。绵羊与人类卵巢无论是卵巢组织结构及排卵周期均较为相似，因此绵羊卵巢组织冻融并移植后获得成功的妊娠，为人类卵巢组织冻融技术的发展和应用提供了有意义的模型，并奠定了坚实的实验基础。DonnezJ在腹腔镜下对一例何杰金氏患者自体原位移植了冻存6年的卵巢组织，随访发现该患者术后半年就恢复了月经周期，并有周期性排卵及黄体生成，术后11个月HCG测定和B超证实患者成功妊娠，并顺利分娩。我国开展卵巢组织冷冻技术还处于摸索阶段，陈子江等研究冷冻人卵巢皮质，观察卵巢皮质内各级卵泡形态及卵巢组织体外培养获得了一定的经验。
　　 卵巢组织冷冻保存的优势在于其可冷冻卵巢皮质原位未成熟的始基卵泡，因其具有相对静止、体积小、缺乏透明带及皮质颗粒的特性，容易耐受冷冻及复苏造成的损伤，成功的卵巢组织冷冻和复苏，可保存卵巢组织中大量结构完整、具有生存活力及发育能力的原始卵泡，从而开辟了一条卵巢早衰和恶性肿瘤患者的治疗新途径。有效的卵巢冷冻保存及复苏技术是建立卵子库的基本前提，复苏后卵巢组织的成功移植对女性生育力的保存及恢复具有重要意义。为了拯救面临威胁和濒危动物，保存基因多样性，世界各地基因组储存中心正在收集和冷冻来自这些动物的卵巢组织。
　　 卵巢冷冻保存及复苏还存在许多有待解决的问题，虽然在鼠类和大型灵长类动物中卵巢组织冷冻保存技术已有后代出生并获得了阶段性的研究成果，但用于人类卵巢组织的冷冻保存及复苏移植技术还存在许多问题，难以充分有效地的运用于临床，其关键难点包括确立最适宜的卵巢组织冷冻保存方案，因为冷冻过程中各个环节均有许多因素会影响卵巢组织的冻融效果，如组织切块的大小，所选择的冷冻方法、冷冻保护剂的种类及浓度、冷冻和复苏过程、操作人员的技术水平、硬件设备条件等，目前尚无定论的减少冷冻损伤的最佳冷冻方案。
　　 卵巢组织复苏移植后的成活情况是决定生殖能力能否恢复的关键。影响移植成功的因素有很多，首先是移植后局部灌注损伤:Aubard等学者在羊卵巢组织自体移植模型实验中发现，只有5％的原始卵泡在移植后能够存活，分析原因可能是移植后的卵巢未行血管吻合，自身无血供，而移植局部的血管再生至少需要48小时，在此期间由于血供不足可能对卵巢造成了不可逆的损伤，如何保护移植组织不受缺血缺氧损害是卵巢组织冻融后移植亟待解决的一个问题;其次是最适宜移植部位的确立:迄今为止，国内外研究尚无最适宜卵巢组织移植的最佳部位定论，但能确认的是最适宜的移植部位必须具备能为组织的植入和成活发育提供良好条件、并且方便卵泡的检测和穿刺取卵的部位;最后是卵巢组织同种自体移植后的安全性问题的解决:卵巢组织的冷冻和移植的不断进步，为癌症患者恢复其自身卵巢功能和保存生育能力带来了新的希望。但卵巢组织移植仍然存在着一定的风险。冻融卵巢组织同种移植多数是为了对恶性肿瘤患者的生育能力进行保存，因此有学者质疑，移植恶性肿瘤患者的冷冻卵巢组织中是否存在微小癌灶，从而导致移植后肿瘤细胞发生播散或者再复发。MuellerA等实验研究发现大鼠卵巢经同种异位移植后，发生性索间质瘤的几率达100％。关于移植组织安全性的监测，Dror等研究表明采用RT-PCR能够敏感的检测到癌症患者卵巢组织内残存的微小病灶，从而提高移植的安全性。因此，在决定移植前，采用先进的检测手段如聚合酶链反应(PCR)、FISH、基因芯片等技术，检测移植卵巢组织内残存的微小病灶，以降低卵巢移植所带来的肿瘤细胞转移风险，有利于提高卵巢组织移植的有效性和安全性。
　　 关于卵巢组织冷冻、复苏、移植研究所采用的标本，人类卵巢组织冻存研究标本大多来自于因卵巢疾患而需要进行妇科手术的病人，由于她们年龄一般都比较大，卵巢中某些区域整群卵泡已经耗尽，同时合并有子宫内膜异位囊肿等卵巢病变，所以很难获得足够数量的卵泡标本，而且人类卵巢组织的冷冻、复苏、移植涉及诸多伦理问题，所以实验标本的获得非常珍贵而有限，实验数据不够充沛。有研究显示种属间卵巢原始卵泡没有明显差异，本实验前期选择家兔卵巢组织来进行研究，是由于其低廉的价格，广阔的来源，较短的繁殖周期，且人类与家兔卵巢始基卵泡中卵母细胞的大小及进入减数分裂的卵母细胞微细结构基本相似。在前期家兔卵巢冻存研究基础上，我们又对来自卵巢手术剥离的人类卵巢组织标本进行了冷冻、复苏和移植的研究。
　　 本研究分四个部分，即家兔卵巢组织冷冻复苏的实验研究、家兔卵巢组织异种异位移植的实验研究、人卵巢组织冷冻复苏的实验研究、人卵巢组织异种异位移植的实验研究四个阶段。通过采用不同冷冻程序（慢速程序化法、快速玻璃化法）、不同冷冻载体（麦管法、微滴法、坚硬表面法）、不同冷冻试剂及配伍方法（二甲基亚砜DMSO、乙二醇EG、丙二醇PROH）等分别对家兔及人卵巢组织进行了冷冻、复苏、体外培养、异体移植的系统研究，以期寻找适宜的卵巢组织冷冻复苏方案及移植部位，为临床开展人类卵巢组织冷冻及移植提供实验数据参考，为建立卵巢组织冷冻库奠定基础。
　　 第一部分:家兔卵巢组织冷冻复苏的实验研究
　　 研究目的:
　　 采用不同冷冻保护剂（PROH、DMSO及EG）单独或联合应用于程序化或玻璃化法对家兔卵巢组织进行冷冻并复苏，观察复苏后卵巢组织中各级卵泡形态、卵巢组织Ⅱ型跨膜酪氨酸激酶受体(c-kit)和增殖细胞核抗原(ki67)以及主要组织相容性复合体类抗原(MHC-2)表达的变化，从而判断各种冷冻方案对家兔卵巢组织形态学、细胞增殖活性、卵巢组织抗原性的影响，以探讨相对适用于卵巢组织的冷冻复苏方案。
　　 研究方法及结果:
　　 1、四种不同冷冻复苏方法对家兔卵巢组织形态学的影响
　　 1.1、研究对象及分组:选择清洁级性成熟雌性日本大耳白兔12只，随机分为四组，麻醉后开腹取其卵巢组织并切成1×1×1mm3块，按随机方法分组将家兔卵巢组织块分别进行慢速程序化(分A2及B2两个亚组，冷冻剂分别采用PROH、DMSO)及快速玻璃化(分C2及D2两个亚组，冷冻剂分别采用DMSO+PROH、DMSO+EG)冷冻并复苏;冷冻前每组各取少量新鲜卵巢组织块做为对照组(A1、B1、C1、D1)。
　　 1.2、研究内容:通过卵巢组织学检测，观察新鲜对照组及各冷冻复苏组卵巢组织内各级卵泡比例、形态结构及正常形态率等变化。
　　 1.3、研究结果
　　 1.3.1、新鲜及冷冻复苏家兔卵巢组织形态学特点:来自各组家兔的新鲜卵巢组织切片中，显微镜下共计数各级卵泡1236枚，其中始基卵泡所占比率(88.2％)及其正常形态率(91.4％)均最高，初级卵泡及次级卵泡比率分别为8.4％和3.4％;计数来自三组冷冻复苏卵巢组织切片中的卵泡共954枚，其中始其卵泡857枚，占89.8％，初级卵泡占7.3％，次级卵泡仅占2.8％。
　　 1.3.2、采用不同冷冻程序和冷冻剂处理后家兔卵巢组织各级卵泡形态学的变化:冷冻组中，以PROH慢速程序化冷冻组始基卵泡的形态正常率最高，达80.1％，明显高于DMSO程序化组(70.5％)及两组玻璃化组（DMSO+PROH及DMSO+EG组分别为67.6％，69.7％），差异有统计学意义;将各冷冻组所观察到的各级卵泡合并计算，其中始基卵泡形态正常率(72.7％)，明显高于初级卵泡的形态正常率(55.7％)，因次级卵泡总数极少，所以未行统计学分析。
　　 1.3.3、冷冻复苏前后家兔卵巢组织结构变化:镜下观察冷冻前家兔卵巢组织内可见排裂规则的卵巢间质细胞紧密包裹的各级卵泡。所有冷冻复苏组卵巢组织均可见以初级卵泡和次级卵泡为主的受损情况，这些卵泡与周围间质细胞分离，但始基卵泡受影响较小;各冷冻组卵巢间质细胞排裂紊乱、连接疏松，形成裂隙。
　　 2、程序化及玻璃化冷冻对家兔卵巢抗原性及卵泡细胞增殖活性的影响
　　 2.1、研究对象及分组:选择9只4～5月龄清洁级性成熟雌性日本大耳白兔，随机分为3组（新鲜对照组、PROH慢速程序化冷冻组、DMSO+EG快速玻璃化冷冻组），获取卵巢组织方法如前所述，切块待用。
　　 2.2、研究内容
　　 2.2.1、家兔卵巢组织相容性抗原(MHC-2)的表达:应用SP免疫组化法检测上述新鲜组及经两种冷冻方法处理后家兔卵巢组织MHC-2抗原表达的变化，通过观察MHC-2抗原的平均吸光度值，判断冷冻对卵巢组织抗原性的影响。
　　 2.2.2、冷冻复苏对各级卵泡细胞增殖活性的影响:分离新鲜对照组及冷冻复苏组卵巢组织内大、小卵泡（直径分别为100-150μm及300-500μm），对其进行体外培养后，采用3H标记的胸腺嘧啶核苷掺入试验(3H-TdR)，移入液闪瓶中上机测其脉冲信号数(cpm)，判断冷冻复苏对各级卵泡细胞增殖活性的影响。
　　 2.3、研究结果
　　 2.3.1、PROH程序化与DMSO+EG玻璃化冷冻法对家兔卵巢MHC-2表达的影响:免疫组化结果显示MHC-2主要表达于卵巢间质细胞和次级卵泡卵母细胞的胞膜，而始基卵泡及初级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞均无表达;玻璃化冷冻组较程序化组和新鲜对照组卵巢组织MHC-2抗原的平均吸光度值明显降低;程序化组与新鲜对照组平均吸光度值无明显差异。
　　 2.3.2、PROH程序化与DMSO+EG玻璃化冷冻法对家兔卵泡细胞增殖活性的影响:通过3H-TdR掺入试验检测各组卵泡细胞增殖活性发现，程序化及玻璃化冷冻组与新鲜卵巢组小卵泡的cpm值差异无统计学意义，而冷冻组大卵泡的cpm值明显降低;两冷冻组间差异无统计学意义。
　　 3、不同玻璃化冷冻载体对家兔卵巢组织c-kit和ki67表达的影响
　　 3.1、研究对象及分组:选择12只4～5月龄清洁级性成熟雌性日本大耳白兔，按是否冷冻及玻璃化冷冻所选择的载体不同随机分为4组:新鲜对照组（A组）、麦管法玻璃化冷冻组（B组）、微滴法玻璃化冷冻组（C组）、坚硬表面法(SSV)玻璃化冷冻组（D组）。玻璃化冷冻试剂采用EG+DMSO;获取家兔卵巢组织方法如前所述，将卵巢组织切块待用。
　　 3.2、研究内容:通过对冻融卵巢组织的组织学观察，并采用免疫组化法检测冻融卵巢组织Ⅱ型跨膜酪氨酸激酶受体(c-kit)和增殖细胞核抗原（Ki67）表达，判断冷冻对卵巢组织增殖活性及发育潜能的影响。
　　 3.3、研究结果:采用免疫组化检测家兔新鲜及冻融卵巢组织，结果显示各级卵泡内卵母细胞的胞膜和/或胞浆中ki67蛋白均出现呈棕黄或棕褐色的阳性表达;与新鲜组相比较，经麦管法、微滴法、SSV法冷冻处理后Ki67和c-kit阳性率表达率差异无统计学意义。
　　 结论:
　　 1、PROH慢速程序化冷冻方法用于家兔卵巢组织冷冻获得了较高的始基卵泡正常形态率及细胞增殖活性，可能是一种较好的冷冻方法。
　　 2、玻璃化方法虽使始基卵泡形态正常率降低，但也能使始基及初级卵泡卵母细胞保持良好的增殖活性，并可降低家兔卵巢组织抗原性，可能会减轻复苏后卵巢组织移植的免疫排斥，加之该技术操作简便，费用低廉，可能会有良好的应用前景。
　　 3、程序化冷冻及玻璃化冷冻对形态结构完整的小卵泡细胞增殖活力影响不明显，而大卵泡增殖活性明显下降。
　　 第二部分:家兔卵巢组织异体异位移植的实验研究
　　 研究目的:
　　 在前期研究基础上，选择低浓度配伍比的DMSO+EG做为冷冻保护剂，玻璃化冷冻家兔卵巢组织，将新鲜及冷冻复苏后卵巢组织块分别移植于去势裸鼠颈部皮下，观察接受移植后裸鼠动情周期、激素分泌、子宫形态变化及移植物变化，以评价冷冻效果。
　　 研究方法:
　　 1、研究对象及分组
　　 选择清洁级性成熟雌性日本大耳白兔4只，取其卵巢组织处理后切块，分三组用于新鲜组织观察、新鲜移植、冷冻复苏移植;移植宿主采用8～10周龄的SPF级性成熟雌性Nu/Nu裸鼠36只，分4组（每组9只），除正常对照组外，其余三组均切除双侧卵巢去势，之后分别用于新鲜组织移植、冻融组织移植及去势对照组。
　　 2、研究方法
　　 2.1、卵巢组织冷冻复苏方法:采用低浓度比二甲基亚砜(DMSO)+乙二醇(EG)作为冷冻保护液，通过坚硬表面铜块(SSV)法对卵巢组织进行玻璃化冷冻后快速复苏。
　　 2.2、卵巢组织移植:麻醉裸鼠后，消毒并切开裸鼠左侧颈部皮肤，眼科镊分别夹取新鲜或冻融家兔卵巢组织多点移植于颈部皮下，缝合并标记移植部位。
　　 2.3、家兔卵巢组织冷冻复苏后移植的效果评价
　　 2.3.1、裸鼠阴道脱落细胞学观察:每天观察各组裸鼠阴道涂片上皮细胞变化以判断裸鼠动情周期恢复及持续时间。
　　 2.3.2、裸鼠血中雌激素测定:全部正常对照组及部分移植组裸鼠有动情周期出现;去势未移植组无动情周期。分别测定对照组、去势组及移植后出现动情周期的裸鼠血清雌激素(E2)水平，判定卵巢功能情况。
　　 2.3.3、裸鼠子宫形态学观察及移植物观察:移植35天后，切除各组裸鼠完整的子宫，分别于肉眼及镜下观察其形态学变化;切开新鲜及冷冻卵巢移植组裸鼠颈部皮肤，取出移植物，进行组织学观察。
　　 研究结果:
　　 1、裸鼠动情周期情况
　　 正常对照组裸鼠全部有规律的动情周期;新鲜移植组9个裸鼠中7个出现动情周期，冷冻移植组9个中6个出现动情周期，两移植组裸鼠恢复动情周期天数无差异，正常及移植组动情周期持续天数无差异。
　　 2、裸鼠血中雌激素水平测定
　　 测定全部出现动情周期的裸鼠和去势裸鼠血中E2水平，两移植组恢复动情周期的裸鼠血中E2水平与正常对照组无明显差异，均明显高于去势组。
　　 3、裸鼠子宫形态学观察
　　 去势组裸鼠子宫明显有别于有动情周期的裸鼠子宫，呈萎缩、苍白状，内膜薄，腺体少，表面被覆立方或者单层扁平上皮细胞;而正常对照及移植组裸鼠子宫色泽红润而有弹性，形态饱满，内膜厚且腺体粗大、量多，腺细胞胞浆丰富，内膜表面被覆单层高柱状或假复层上皮细胞。
　　 4、卵巢组织移植物形态学观察
　　 取出裸鼠颈部皮下移植物进行观察，新鲜移植组与冷冻移植组移植物肉眼可见大部分长成淡黄色圆形或椭圆体，体积增大明显，移植物柔软，部分移植组织块表面出现凹凸不平的串珠状突起。存活的移植物镜下可见毛细血管生成，皮质内可见到各级卵泡及闭锁卵泡。
　　 结论:
　　 采用低浓度DMSO+EG玻璃化冷冻法能够较好地保存卵巢组织的结构和功能，新鲜及冻融后的家兔卵巢组织裸鼠异种异位移植后能够存活，并具有内分泌功能。
　　 第三部分:人卵巢组织冷冻复苏的实验研究
　　 研究目的:
　　 以不同浓度配伍的DMSO+EG做为玻璃化冷冻保护剂，分别以麦管法、微滴法及SSV法对人卵巢组织进行玻璃化冷冻，通过观察冷冻前后人卵巢组织中卵泡形态学变化、细胞凋亡率检测及复苏后卵巢组织体外培养上清液3E2测定，评价不同冷冻复苏方案的效果。
　　 研究方法:
　　 1、研究对象
　　 2008.7～12月共收集20例因卵巢疾病而行腹腔镜手术的患者剥离的卵巢囊肿壁上残留组织，利用患者手术切除的废弃组织进行研究，该研究通过伦理委员会审核，并经患者知情同意。将收集到的卵巢组织切成约1×1×1mm3的组织块待用。
　　 2、研究内容
　　 2.1、卵巢组织冷冻及复苏:通过采用不同浓度的DMSO和EG制备两组玻璃化试剂（低浓度Ⅰ组，高浓度Ⅱ组）。将卵巢组织块分别在平衡液中和两种玻璃化冷冻液中浸泡暴露一定的时间后，再分别将卵巢组织块通过微滴法、麦管法和SSV法进行玻璃化冷冻，快速复温后进行组织学检查及体外培养。
　　 2.2、复苏后人卵巢组织体外培养:定期收集组织培养上清液进行E2测定，14d后捞出卵巢组织块，固定染色行组织学检测。
　　 2.3、人卵巢组织冷冻复苏效果判断:
　　 2.3.1、冷冻前后卵巢组织中卵泡形态学分析:在卵巢组织块冷冻前后和体外培养14d后，观察各组卵巢组织结构及卵泡形态变化，计数正常形态和异常改变的卵泡比率，检测卵巢皮质内卵泡密度与分布以及各级卵泡的比例变化。
　　 2.3.2、冻融卵巢组织各种细胞凋亡情况:采用DNA断裂原位末端标记法检测(Tunel)试剂盒，从DNA水平上检测冻融后卵巢组织内各种细胞凋亡情况。
　　 2.3.3、卵巢组织体外培养上清液中雌二醇的检测:每48小时采集卵巢组织体外培养上清液，离心后保存在-80℃的冰箱中，以RIA法测定上清液中E2水平。
　　 结果:
　　 1、冷冻前后人卵巢组织中卵泡形态及各级卵泡比例变化
　　 DMSO+EG高浓度配伍Ⅱ组原始卵泡正常形态率(43.7％)较新鲜对照组(75.5％)及低浓度Ⅰ组(69.4％)明显下降，三组间各级卵泡所占比例无明显差异，均以始基卵泡比例最高。
　　 2、冷冻复苏后人卵巢组织结构形态学变化
　　 新鲜人卵巢组织间质细胞排裂致密而规则，卵巢皮质中间质细胞紧密包裹各级卵泡。经两种不同配伍比例的玻璃化冷冻液处理并分别采用三种载体冷冻保存的人卵巢组织复苏后对始基卵泡影响不明显，但可见卵巢组织内部分间质细胞排列紊乱，疏松甚至出现分离。
　　 3、人卵巢组织各类细胞冷冻复苏后凋亡情况
　　 冻融后人卵巢组织中各级卵泡中都没有出现阳性表达的棕色或棕褐色凋亡细胞;而卵巢组织内间质细胞的细胞核内发现有凋亡细胞。经单因素方差分析，玻璃化冷冻各组卵巢组织内间质细胞凋亡率与新鲜对照组相比，差异无统计学意义。
　　 4、各冷冻组复苏后卵巢组织体外培养液中E2的变化
　　 低浓度配伍Ⅰ组各载体组卵巢组织培养液中E2的分泌水平均高于高浓度配伍组Ⅱ各载体组，其中SSV法载体间差异更显著，而各冷冻组内载体间差异无统计学意义。
　　 结论:
　　 1、人卵巢组织内始基卵泡对冷冻损伤的耐受性高于初级卵泡。
　　 2、低浓度的冷冻保护剂配合SSV法玻璃化冷冻方案对保存人卵巢组织的效果较佳。
　　 第四部分:人卵巢组织异种异位移植的实验研究
　　 研究目的:
　　 在前期研究基础上，采用低浓度比DMSO+EG做为冷冻保护剂，通过SSV法对人卵巢组织进行玻璃化冷冻复苏，并将人卵巢复苏组织块多点移植至去势裸鼠颈部皮下，观察接受移植的裸鼠阴道脱落细胞学、血E2分泌及子宫形态学变化，以判断冷冻效果。
　　 研究方法:
　　 1、研究对象及分组
　　 2009.11～2010.3，收集20例因卵巢疾病而行腹腔镜手术的患者剥离的卵巢囊肿壁上残留组织，利用患者手术切除的废弃组织进行冷冻复苏及异体移植研究，并在短期内处死移植裸鼠进行观察，对冷冻及移植效果进行评价，未对患者造成任何伤害，该研究通过伦理委员会审核，并经患者知情同意。将收集到的卵巢组织切成约1×1×1mm3的小块待用。移植宿主采用健康性成熟Nu/Nu裸鼠，按是否移植分为四组（正常对照组、新鲜移植组、冻存移植组、去势组），后三组裸鼠切除双侧卵巢去势。
　　 2、研究内容
　　 2.1、冷冻及复苏:采用低浓度比DMSO+EG通过SSV法对卵巢组织进行玻璃化冷冻，快速复温法进行复苏。
　　 2.2、卵巢组织移植方法:分别将新鲜及冻融复苏后人卵巢组织多点移植于相应组别裸鼠左侧颈部皮下。
　　 2.3、观察指标:
　　 2.3.1、裸鼠阴道脱落细胞学观察:移植术后第5天起每日对裸鼠阴道细胞学检测观察动情周期。
　　 2.3.2、裸鼠血雌激素水平测定:分别于动情期采集移植组裸鼠血测定血清E2水平，判定卵巢功能情况;去势裸鼠于处死前采血检测。
　　 2.3.3、裸鼠子宫形态观察及移植物收集:甲醛固定切除的各组裸鼠子宫，切片染色后于光镜下观察子宫内膜腺体和间质的形态;切开移植组裸鼠颈部移植部位寻找卵巢组织移植物。
　　 结果:
　　 1、移植后裸鼠动情周期恢复情况
　　 正常对照组阴道细胞呈持续规律的动情周期性变化，新鲜移植组中4/9裸鼠恢复动情周期，冷冻移植组3/9裸鼠恢复动情周期;去势组阴道有核上皮细胞和角化细胞逐渐消失，白细胞大量增加，脱落细胞未见周期性变化。新鲜移植组裸鼠首次恢复动情周期时间[(19.0±1.6)d]稍早于冷冻移植裸鼠[(22.3±1.2)d]，但两组动情周期持续天数[(5.0±0.8)、(5.8±1.2)d]与正常对照组[(4.8±0.7)d]比较，差异无显著性意义。
　　 2、移植组裸鼠子宫形态学变化
　　 移植组小鼠子宫增粗红润，弹性好，与正常对照组相似。移植组与正常组裸鼠子宫湿重明显重于去势对照组。光镜下观察，正常对照组及移植组裸鼠子宫内膜间质疏松，内膜腺体粗大、量多，腺细胞呈高柱状，胞浆丰富，有假复层上皮细胞。与之相反，去势组裸鼠子宫变细变薄，外观苍白，内膜萎缩变薄，间质致密，腺体数量少，腺腔较小，腺细胞呈静止期表现。
　　 恢复动情周期的移植组裸鼠虽有动情周期出现并有与正常对照组相近的E2分泌水平，但颈部移植部位却未寻找到明显移植物。
　　 3、裸鼠血清平均E2水平
　　 新鲜与冷冻移植组有动情周期的裸鼠血清平均E2水平与正常对照组无明显差异，均显著高于去势裸鼠组。
　　 结论:
　　 1、采用低浓度比DMSO+EG冷冻剂SSV法玻璃化冷冻人卵巢组织，复苏后行异体异位移植可获得与新鲜卵巢组织移植相同的效果。
　　 2、人卵巢组织异体异位裸鼠颈部皮下无血管吻合移植能够存活并恢复裸鼠动情周期及内分泌功能。

目录

声明

摘要

中英文缩略词汇对照表

引言

第一部分：家兔卵巢组织冷冻复苏的实验研究

1 研究对象及实验材料

2 研究内容及结果

3 讨论

4 结论

附图

第二部分：家兔卵巢组织异种异位移植的实验研究

1 研究对象及材料

2 研究方法及内容

3 结果

4 讨论

5 结论

附图

第三部分：人类卵巢组织冷冻复苏的实验研究

1 研究对象及材料

2 研究方法及内容

3 结果

4 讨论

5 结论

附图

第四部分：人卵巢组织异种异位移植的实验研究

1 研究对象及材料

2 研究方法及内容

3 结果

4 讨论

5 结论

附图

参考文献

附录一 知情同意书

附录二 研究知情同意书

附录三 郑州大学第三附属医院妇科手术同意书

综述

致谢

个人简历

在学期间发表的论文和科研成果