人体大块卵巢组织玻璃化冷冻及异种移植研究

摘要

背景及目的：
　　近年来越来越多的恶性肿瘤患者受益于医疗技术的发展及进步，与此同时全身化疗及放疗带来的弊端也日益显现。年轻女性患者在接受大剂量化学药物治疗或放疗的同时，性腺器官受损导致的功能衰竭或丧失等问题也随之而来。随着人们对生活质量的追求越来越高，越来越多的肿瘤患者迫切的希望能够在抗肿瘤治疗前保存生殖功能。卵巢组织的冷冻保存是保存女性生殖功能的方法之一，较为常用的是经典的慢速程序化冷冻方案，但程序化冷冻需配备要求较高的仪器设备，费用昂贵，同时在细胞保存方面存在一定弊端。随着冷冻技术的逐步提高，玻璃化冷冻技术成为近年来出现的一种新的冷冻方法。
　　玻璃化冷冻技术将细胞或组织等直接投入液氮中，通过快速的降温速率，可以绕开组织内不同细胞成分对慢速冷冻参数要求不同的技术障碍，形成一种玻璃化状态，避免细胞内冰晶形成，减少对细胞结构的损伤，从而提高冷冻保存效果。然而相较于卵子、胚胎的玻璃化冷冻及卵巢组织的程序化冷冻，卵巢组织玻璃化冷冻方案仍被认为处于不成熟的实验性阶段，目前国内尚未见人卵巢组织经玻璃化冷冻并移植后获得成功妊娠的报道，而经程序化冷冻并移植已见活产报道。
　　目前尚无标准化的卵巢组织玻璃冷冻方案，但大多数研究中所使用的卵巢组织薄片均选择冻存小块卵巢组织(面积<1cm2，厚度1mm)，原因可能是为了使冷冻保护剂更容易渗透。但卵巢组织过小，存在一定弊端，一方面切割过程中容易形成较多废弃组织，而通过冷冻大块的卵巢组织能获取更多的卵泡，并且组织内结构能更好地支持卵泡生长，另一方面卵巢组织在冻存过程及移植后血管再生过程中存在丢失大量卵泡的缺点。基于上述原因，冻存小块卵巢皮质组织并进行移植的生殖力保存效果将明显降低。
　　从理论上讲，冻存一定数量的卵泡对于卵巢功能的维持及女性生殖能力的保护是有益的，对于即将接受具有明显毒副作用大剂量放化疗的女性恶性肿瘤患者来说更是如此。虽然目前应用玻璃化方法冻存人卵巢组织的研究已有陆续报道，却鲜少见关于人体大块卵巢组织进行玻璃化冷冻的报道。
　　本研究通过改进卵巢组织薄片的切割方法调整玻璃化冷冻方案对人体大块卵巢组织进行玻璃化冷冻，并与程序化冷冻方案的冻存效果进行比较，在解冻后进行组织学分析并采用DNA断裂的原位末端标记法(TUNEL)进行凋亡检测，并将卵巢组织在解冻后移植至免疫缺陷的裸鼠皮下，3周后取出，采用免疫组织化学法检测Ki-67抗原的表达情况评估移植后卵泡活性,以探讨人体大块卵巢组织进行玻璃化冷冻的可行性。
　　材料与方法：
　　收集2013年12月-2015年9月期间郑州大学第一附属医院妇科行腹腔镜下或开腹手术切除卵巢的18例人体卵巢组织，每例标本修剪成3片大块卵巢皮质薄片（1mm(厚)×10mm（宽）×18mm（长）），将组织薄片随机分为三组：玻璃化冷冻组（A组），程序化冷冻组（B组），新鲜对照组（C组），对各组卵巢组织进行HE染色进行形态学分析及TUNEL染色进行凋亡检测，在进行裸鼠异种移植后3周回收卵巢组织片计算卵泡密度检测卵泡保存情况，并用免疫组织化学法检测Ki-67抗原的表达情况评估卵泡活性。
　　结果：
　　（1）解冻后的A组形态正常的始基卵泡比例（79.6％）与B组（74.5%）相比差异无统计学意义(P＞0.05)；
　　（2）各冷冻组卵泡凋亡发生率明显高于新鲜对照组，但A、B组无明显差异(P＞0.05)。间质细胞凋亡率A组低于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；
　　（3）移植后各组卵泡密度无明显差异；Ki-67抗原在卵母细胞、颗粒细胞和卵巢组织间质细胞均有散在表达，卵泡阳性率A组与B组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　（1）玻璃化冷冻在保存卵巢间质细胞方面可能具有一定优势。
　　（2）人体大块卵巢组织进行玻璃化冷冻具有一定可行性，但该方案还需要更进一步研究和完善。

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中英文缩略词对照表

1 前言

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验设备

2.1.2 实验器材与耗材

2.1.3 主要实验试剂

2.1.4 主要的配制

2.1.5 动物来源

2.1.6 标本来源

2.2 研究方法

2.2.1 标本处理

2.2.2 玻璃化冷冻及解冻

2.2.3 程序化冷冻及解冻

2.2.4 异种移植

2.2.5 冻存后卵巢组织形态学分析

2.2.6 冻存后卵巢组织凋亡检测

2.2.7 移植后卵泡活性测定

2.2.8 统计学分析

3 结果

3.1 卵巢组织形态学分析

3.2 各组始基卵泡及间质细胞凋亡发生率比较

3.3 移植物回收及形态学分析

3.4 移植物卵泡活性分析

4 讨论

5 结论

附图

参考文献

综述: 卵巢组织玻璃化冷冻研究进展

致谢

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