半抗原诱导食物过敏发生机制及肥大细胞对Th2型过敏反应的调控作用

摘要

随着社会工业化、环境的污染，化学物质，特别是半抗原通过皮肤，呼吸道，消化道等途径暴露机会的增多，过敏性疾病也呈明显上升趋势，食物过敏和相关疾病在全球范围内迅速增加，大约4％-8％的儿童和1％-2％的成年人对食物抗原具有IgE介导的高反应性。食物过敏(foodallergy)的症状轻则表现为轻度不适，重则表现为威胁生命的过敏性休克，已经成为了对社会、经济巨大影响的疾病。最近几年有关食物过敏领域的研究进展迅速，但其发病机制仍不清楚。
　　 半抗原(Hapten)是小分子量化学物质(＜500Da)，自身不能引起免疫反应，但易于和蛋白或肽结合并影响或改变蛋白的免疫原性，从而引起机体对该种蛋白的致敏。研究显示，半抗原引起的致敏占过敏性疾病发病的2％-15％左右，“半抗原-特应性过敏假说”（Hapten-AtopyHypothesis）提出通过消化道或皮肤接触化学物质，特别是半抗原暴露的增加，在过敏性疾病的发病机制中可能具有重要作用，并导致了过敏性疾病的明显增加。然而，目前为止，有关半抗原暴露导致的过敏性疾病其具体发病机制仍不十分清楚。近年来，随着食物过敏的增加，通过食物加工、配方奶粉、抗生素和其他药物等口服途径接触的半抗原成分也明显增加。半抗原通过口服途径暴露并与食物蛋白相结合是否能够改变食物抗原的免疫原性，并成为食物过敏性疾病增加的环境诱导因素仍有待进一步研究。
　　 T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域蛋白(TIM)-1表达于活化的辅助性T细胞，TIM4是TIM1的配体，活化的树突状细胞(dendriticcell，DC)表达TIM4。研究表明，TIM1与TIM4之间的相互作用在启动抗原特异性的Th2反应方面起重要作用，例如当暴露于微生物产物葡萄球菌肠毒素(SEB)时能够诱导DC表达TIM4。DC能够被三硝基苯磺酸(TNBS)活化，然而，是否经TNBS活化的DC也能够表达TIM4仍不清楚。
　　 食物过敏是以肠道口服耐受受损和Th2(T-helper)极化为特征的免疫反应，同时产生食物过敏原特异性IgE抗体。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，能够有效的激活B细胞产生IgE抗体，IgE与肥大细胞结合，并导致肥大细胞脱颗粒释放丝氨酸蛋白酶、组胺、细胞因子等介质，启动针对特异性抗原的过敏反应。研究显示，肥大细胞不仅是过敏反应中一种关键的效应细胞，而且能够调控很多其它组织功能并参与调控固有免疫和特异性免疫及外周耐受的形成。肥大细胞已经被看做像淋巴细胞和其它重要免疫细胞一样，在机体防御及稳态中具有重要作用。丝氨酸蛋白酶是肥大细胞释放介质的一种，研究显示其具有很强的免疫调控功能。另外，一次接触抗原后诱发的速发型免疫炎症反应往往能够自我平息，这种在急性过敏反应中起到自我限制和调控的具体因素仍未阐明。
　　 既然肥大细胞具有免疫调控功能，除了引起过敏炎症反应，肥大细胞可能也在速发型过敏反应的调控和自限过程中发挥作用。丝氨酸蛋白酶能够通过结合蛋白酶活化受体(protease-activatedreceptors，PAR)-1和PAR-2，从而进一步调控靶细胞。炎症反应时，肥大细胞和其他免疫细胞，如Th2细胞，在炎症局部聚集，从而有机会发生相互作用。研究显示，Th2细胞表达PAR-2和Bcl-6，是否肥大细胞来源的丝氨酸蛋白酶能够通过激活PAR-2来调控Th2中Bcl-6的表达仍不清楚。人类B细胞淋巴瘤蛋白-6(Bcelllymphoma6protein,Bcl-6)由Bcl-6基因编码，它是一种进化相对保守的锌指结构转录因子，又被称作Bcl-6转录阻遏因子，近来研究表明，Bcl-6在一类调节性T细胞中具有重要的免疫调控功能，且能够干扰IL-4基因的转录过程。来源于Th1和Th2细胞的不同细胞因子其表达量受基因转录水平调控，而Bcl-6将可能是影响Th2反应中的关键基因转录调控因子之一。
　　 为维持免疫稳态，机体存在一种调控和限制免疫反应的机制，除了活化诱导的细胞死亡（AICD）机制外，调节性T细胞(Tregs)在免疫反应的负向调控方面也具有重要作用。Tregs功能失常将导致过敏性疾病的发生，导致口服耐受受损和以Th2细胞为主的过敏反应。IL-4和IL-13是Th2细胞分泌的主要细胞因子，在过敏性疾病，如过敏性哮喘、接触性皮炎和食物过敏发生时，Th2型细胞因子会明显增加。研究显示，Tregs能够调控Th2型免疫反应以免产生自身组织的损伤。然而，目前，启动针对Th2型免疫反应调控的起始因素仍有待进一步研究。调节性T细胞分为两种，自然状态Tregs和可诱导Tregs，自然状态Tregs在胸腺中产生，而可诱导Tregs则在外周组织中，当受到适当刺激时产生。CD4+T细胞的可塑性最近几年才被认识，通常CD4+T细胞并未达到分化末期，在一定的细胞因子环境下，保留着进一步分化为其他亚型CD4+T细胞的潜能。从辅助性T细胞中产生的各种细胞因子之间的相互影响及其平衡在维持机体免疫稳态方面起重要作用，然而其协调合作的内在机制仍不明了。
　　 综上所述，食物过敏发病机制仍未阐明，半抗原通过口服途径暴露并与食物蛋白相结合可能能够改变食物抗原的免疫原性，并成为食物过敏性疾病增加的环境诱导因素。肥大细胞不仅在免疫炎症反应中是一种关键的效应细胞，参与速发型过敏反应，而且，肥大细胞作为效应细胞和启动因素在固有免疫中也起重要作用，是否肥大细胞来源的丝氨酸蛋白酶能够通过激活PAR-2来调控Th2中Bcl-6的表达仍不清楚。本研究中，我们将首先通过细胞培养，探讨半抗原TNBS对DC表型的影响，其次通过给予小鼠TNBS和OVA混合物，建立针对食物抗原的小鼠肠道Th2型过敏反应模型。通过本研究将初步探讨食物过敏发病机制中新的环境诱导因素，并进一步评价模型小鼠肠道中极化的Th2型过敏炎症反应。然后以经典的小鼠卵清蛋白(OVA)肠道Th2型过敏反应模型为研究基础，采用肥大细胞缺陷小鼠，通过过继转移Th2细胞和骨髓来源肥大细胞来研究肥大细胞对肠道抗原特异性Th2型过敏反应的免疫调控功能。采用细胞学实验进一步评价肥大细胞调控Th2细胞表达B细胞淋巴瘤蛋白-6(Bcelllymphoma6protein，Bcl-6)功能和Bcl-6介导Th2细胞转变为调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)的功能。结果显示，TNBS和食物抗原OVA一起能够诱导小鼠肠道极化的Th2型过敏反应。和正常小鼠相比，过继转移Th2细胞能够引起肥大细胞缺陷小鼠肠道强烈的Th2免疫反应，激活的肥大细胞能够引起活化的Th2细胞中Bcl-6表达增加，增加的Bcl-6进一步诱导Th2细胞表达Foxp3(forkheadboxP3)和转化生长因子-β(TGF-β)，而Th2型细胞因子表达则被抑制，从而使之转变为Treg。而转化而来的Treg具有抑制其他Th2细胞活性的功能。本研究结果表明，半抗原可能是食物过敏发病中潜在的环境诱导因素之一，而激活的肥大细胞在抗原特异性Th2免疫反应自我限制和免疫调控中具有重要作用。
　　 方法：
　　 1、骨髓来源树突状细胞(BMDC)的产生及培养
　　 无菌操作台中取小鼠股骨和胫骨，浸入75％乙醇中3-5min，PBS冲洗骨髓腔3次，将骨髓细胞悬液转移至离心管中，离心收集细胞加入红细胞裂解液于室温静置5min，离心后弃上清，再加入RPMI1640培养基10mL重悬细胞。用RPMI1640培养基调整细胞浓度为2×105/ml，均匀后接种于6孔培养板培养，48小时后全量换液，加入新鲜培养液及rmGM-CSF，rmIL-4继续培养，每48h半量换液，并补足相应细胞因子。培养后的BMDC经流式细胞仪(FACS)检测纯度。
　　 2、TNBS对BMDC特性的影响
　　 收集诱导产生的BMDC（纯度＞90％），96孔板培养（2×105细胞/孔）24小时，培养液中加入不同浓度的TNBS（0-200ng/孔）共培养3天，3天后离心收集细胞，ELISA分析TIM4、CD80及IL-12p70表达水平。
　　 3、小鼠肠道黏膜固有层单个核细胞(LPMCs)分离
　　 无菌取小鼠小肠组织放入预冷的PBS中冲洗3次，转移小肠组织到另一个无菌培养皿中，PBS冲洗3次，将小肠组织剪成1cm长大小，转移进15ml离心管，加入含0.15％DDT和1mMEDTA的PBS10ml，放入摇床，37℃、65rpm摇20min。将肠组织剪成1mm大小碎片后放40μm滤网上，用注射器研磨并用PBS冲洗，用50ml离心管收集细胞。1500rpm离心10min去上清，用RPMI1640培养液洗细胞一次，离心后用Percoll分离细胞，收集40％和80％的Percoll之间的悬浮细胞层，加入5mlRPMI1640培养液，1000g离心5min收集细胞培养。
　　 4、免疫磁珠法(MACS)进行细胞分选
　　 密度梯度离心去除死细胞，过滤网制备成单细胞悬液，进行细胞计数，300g×10min离心弃去上清液，重悬细胞，每107加90μl细胞分选缓冲液。每107个细胞总数加入经特异性抗体包被的免疫磁珠10μl，混匀，冰上共孵育15min。加入预冷的缓冲液1.5ml，300g×10min离心收集细胞后重悬，每108个细胞加入500μl缓冲液。把MS型细胞分选柱放入MACS分选架，加入细胞悬液，待液体流干后，加入500μl缓冲液冲洗共3次，收集的细胞为免疫磁珠非结合细胞部分。把分选柱转移出磁场，加入500μl缓冲液后，迅速把与免疫磁珠结合的细胞推出，收集后的细胞为特异性抗体结合细胞。
　　 5、流式细胞仪检测
　　 调整细胞浓度至1×106/ml，经固定液冰上固定30min，离心收集细胞，加入1％的BSA冰上孵育30min。以1∶200的浓度加入一抗，混匀冰上孵育1h，PBS冲洗并离心后，收集细胞，以1∶200的浓度加入荧光标记的二抗，冰上孵育30min，PBS冲洗2次后1500rpm离心5min收集细胞。每管中加入400μl的PBS重悬细胞，40μm滤网过滤以去除细胞团块，进行流式细胞仪(FACSCanto，BDBioscience).分析。
　　 6、半抗原诱导小鼠肠道食物过敏模型的建立
　　 雄性BALB/c小鼠（6-8周），每组6只，在第0、1、2、3、4天灌胃给予小鼠含TNBS（1mg/鼠）和OVA（100μg/鼠）的PBS0.3ml，第9、11、13天再次给予OVA（1mg/鼠）灌胃进行激发，最后一次灌胃24小时后处死小鼠，收集小鼠空肠组织用于下一步分析。
　　 7、肠道空肠组织中炎性细胞计数
　　 取各组小鼠空肠组织经4％的多聚甲醛固定，制作石蜡切片，组织切片经HE染色（单个核细胞和嗜酸性粒细胞计数）和Toluidineblue染色（肥大细胞计数）。显微镜下计数阳性细胞(200×)，每只小鼠肠道随机取20个镜下区域计数。
　　 8、肠道抗原特异性Th2反应评价
　　 分离的LPMC（1×106/孔）经CFSE染色标记，并和OVA共同培养4天，收集细胞FACS分析细胞增殖情况及进一步设门分析增殖细胞中CD3+IL-4+阳性细胞比率，收集培养上清液ELISA分析IL-4、IFN-γ表达量。
　　 9、ELISA进行蛋白表达量检测
　　 收集细胞培养液或小鼠血清-80℃储存待测。设标准孔8孔，每孔加入浓度分别为0pg/mL，31.2pg/mL，62.5pg/mL，125pg/mL，250pg/mL,500pg/mL，1000pg/mL，2000pg/mL的标准品100μL，在其余待测孔中加入待测上清液样本100μL，每个样本设三个重复，用封板膜封上反应孔，37℃60min。用洗涤液充分洗板后，加入酶标试剂50μL，孔板置37℃30min，使用洗涤液充分洗板5次，甩掉洗涤液后倒置于滤纸上控干;每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，混匀4s后将孔板避光置37℃显色15min。然后每孔加入50μl终止液，终止反应，15分钟内在酶标仪450nm处读出吸光度值，减去空白值即为所得吸光度值，根据标准曲线得到样品中蛋白表达浓度。
　　 10、抗原特异性Th2细胞分离培养
　　 分离的OTⅡ小鼠脾脏细胞，经免疫磁珠筛选去除其中CD8+T细胞，细胞(5×105/ml)在RPMI1640培养基中和卵清蛋白肽(OVA323-339)(1μg/ml)、IL-4(2ng/ml)、抗-IFN-γ抗体(5μg/ml)共培养4天。4天后，细胞加入IL-2(10ng/ml)继续培养4天，培养第八天，经MACS去除主要组织相容性复合体(MHC-Ⅱ+)阳性细胞，收集Th2细胞用于下一步实验。
　　 11、骨髓来源肥大细胞的产生
　　 50％的RPMI1640中加入2mML-谷氨酸、0.1mM非必需氨基酸、抗生素和10％胎牛血清，和50％的WEHI-3细胞培养的培养基（作为IL-3的来源）混合制成培养基，培养雄性WBB6F1-Kit+/+(Kit+/+，inshort)小鼠骨髓细胞，共10周。3周后，经流式细胞仪检测BMMC的产生比率。为进一步致敏肥大细胞，106细胞/mlBMMC培养液中加入抗-OVAIgE(500ng/ml)或抗DNPIgE（抗二硝基苯酚抗体），培养过夜。
　　 12、过继转移和Th2细胞的体内激活
　　 雄性清洁级BALB/c小鼠，6～8周，分为两组，每组6只，极化的Th2细胞(107细胞/鼠;经CFSE标记)和BMMCs（2×106细胞/鼠）一起或Th2细胞单独经尾静脉注入小鼠体内。小鼠随后经OVA(0.5mg/鼠)灌胃，每天一次，共3天。第4天处死小鼠，经密度梯度离心法从小鼠小肠分离固有层单个核细胞(LPMCs)。
　　 13、实时定量PCR(qRT-PCR)
　　 收集培养细胞，计数1×107，1500rpm离心后收集细胞，酚氯仿法提取细胞总RNA，所提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计计算浓度，-80℃保存备用。按照反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链合成:在PCR反应Ep管中加入5倍Iscript反应缓冲液4μl，Iscript反转录酶1μl，超纯水13.5μl，RNA模版1μg，调整总反应体系为20μl;反应条件为:25℃5min,42℃40min，85℃5min，反应产物放-20℃保存备用。25ngcDNA加入50μl1×SYBR-GreenIPCRmastermix中，上下游引物各200nM，进行PCR扩增35个循环。所有实验重复三次，阴性对照采用未转录RNA作为模版或不加入模版作为对照。根据标准曲线定量mRNA表达量，标准曲线采用扩增5μl从细胞中获得的不同浓度稀释的总RNA（1.0-0.025ng/μl采用二倍稀释法）。未知标本中mRNA表达量通过标准曲线线性回归方程计算得到，β-actin作为基因表达内参照。
　　 14、RNA干扰（RNAi）
　　 构建的包含小鼠PAR2和Bcl-6的shRNA和对照shRNA慢病毒载体购自SantaCruz，并按照慢病毒载体操作说明转染细胞。复苏Lenti-X293T细胞系，37℃二氧化碳培养箱培养24h，显微镜观察细胞是否贴壁并生长良好。用Lenti-XHTX包装系统进行病毒包装，充分混匀XfectPolymer，每个转染样品需准备2个离心管，充分混匀每管试剂，把管2添加到管1中，迅速涡旋10s，在室温下孵育DNA-Xfect混合物10min，把1200μl的DNA-Xfect溶液加入准备好的293T细胞中，轻轻晃动培养皿，使其均匀，在37℃条件下培养过夜，更换培养基继续培养24h，病毒滴度在48h后可达到最高，吸取慢病毒悬液，500g离心10min，取悬液用Lenti-XGoStix鉴定病毒产物;然后用病毒产物转导靶细胞，转导前12h，在10ml培养基中培养靶细胞至4×106个细胞，用细胞培养液稀释病毒株，获得所需要的MOI(0.5-5)，以得到最佳的转导效率，在靶细胞中加入病毒悬液，转导10h，移除丢弃存留病毒的转导培养液，更换新的培养液，继续培养24-48h，收集细胞进行分析。经westernblot检测，基因抑制效率在转染后48小时达到90％，而对照组shRNA无基因抑制作用。
　　 15、共聚焦显微镜观察
　　 取小鼠空场组织，去掉内容物，PBS冲洗1次，加入OCT后迅速放入液氮中冰冻，冰冻组织切片后（4μm厚），室温放置过夜，经预冷的丙酮固定20分钟，经1％的小牛血清封闭30分钟，加入一抗（0.5-1μg/ml）4℃孵育过夜。PBS冲洗组织3×5min，再加入荧光标记的二抗(0.5-1μg/ml)室温孵育1小时，然后经PBS冲洗3×5min，封片共聚焦显微镜观察。
　　 16、统计分析
　　 数据记录为均数±标准差，所有实验均重复三次，采用非配对双侧t检验或方差分析。Post-hoccomparisons经Bonferroni'stest检验分析。p＜0.05作为显著性水准。
　　 结果：
　　 1、半抗原TNBS可调控树突状细胞(DC)TIM4、CD80和IL-12的表达
　　 在BMDC中有少量的T1M4表达，当在BMDC细胞培养液中加入TNBS后，TIM4表达呈一种剂量依赖性增长（TNBS浓度0-60ng/ml时），而当超过60ng/ml浓度时，加大培养液中TNBS浓度不能增加TIM4表达。BMDC中CD80表达量也随培养液中TNBS浓度增加而增加。为进一步探讨TNBS对DC的影响，取各组小鼠空肠组织分离肠道黏膜DC，westernblot分析DC中TIM4、CD80和IL-12的表达。结果显示，和生理盐水对照组相比，TNBS+OVA组小鼠肠道DC中TIM4、CD80表达量明显增高(p＜0.01)，而DC中IL-12的表达量明显减少(p＜0.01)。
　　 2、经TNBS和OVA共同刺激后小鼠血清中OVA特异性IgE及组胺明显增加
　　 和只灌胃给予OVA或TNBS组相比，TNBS+OVA组小鼠血清中具有高水平的OVA特异性IgE(p＜0.05);TNBS+OVA组小鼠血清中组胺的水平和生理盐水对照组相比明显增加(p＜0.05)。
　　 3、小鼠肠道OVA抗原特异性Th2细胞极化
　　 分离小鼠肠道黏膜LPMC经CFSE标记后培养4天，培养液中加入特异性抗原OVA，FACS结果显示，和单独给予OVA或TNBS灌胃组相比，TNBS+OVA组肠道LPMC中具有明显的细胞增殖，增殖细胞部分经设门分析显示有93.9±12.2％的细胞为CD3+IL-4+T细胞。这一结果表明TNBS与OVA结合可诱导肠道Th2细胞极化。另外LPMC细胞培养液中Th1和Th2型细胞因子检测，结果显示，和对照组相比，TNBS+OVA组小鼠LPMC细胞培养液中具有较高水平的IL-4，而IFN-γ水平较低(p＜0.05)。
　　 4、肥大细胞缺陷小鼠肠道中过继转移的Th2型炎症反应与正常小鼠过继转移的Th2型炎症相比更强烈
　　 经过继转移OVA特异性Th2细胞并经OVA激发组，肥大细胞缺陷W/Wv小鼠肠道中OVA特异性Th2增殖明显增加(39.1％)，而在同时过继转移OVA特异性Th2细胞和经OVA特异性IgE抗体致敏的骨髓来源肥大细胞(BMMC)，并经OVA激发组，肥大细胞缺陷W/Wv小鼠肠道中OVA特异性Th2增殖较少(8.30％)。另外一组肥大细胞正常组Kit+/+小鼠也被过继转移CFSE标记的OVA特异性Th2细胞，并经OVA激发后，CFSE阳性Th2细胞增殖比率和只过继转移了OVA特异性Th2细胞的肥大细胞缺陷W/Wv小鼠组相近(39.7％)。CFSE阳性Th2细胞中IL-4mRNA表达量和Th2增殖比率呈正相关。
　　 5、激活的肥大细胞能够增加Th2细胞中Bcl-6的表达
　　 未经刺激的Th2细胞中可检测出低水平的Bcl-6的表达，而经激活的肥大细胞刺激后，Th2细胞中Bcl-6表达量明显增加，而在培养液中加入加入抗MMCP-6抗体能够阻断Th2细胞中Bcl-6的表达。把极化后的PAR2基因敲除Th2细胞和经OVA特异性IgE致敏的肥大细胞按上述程序共培养，结果显示Th2细胞中的Bcl-6表达量被明显阻断。如在培养体系中加入活性PAR2肽刺激Th2细胞，则Bcl-6的表达量明显增加。预先用p38MAPK或ERK1/2拮抗剂处理Th2细胞，结果显示被激活的肥大细胞诱导的Th2细胞中Bcl-6的表达被明显抑制，本结果表明PAR2相互作用增加Bcl-6的表达是通过MAPK途径实现的。
　　 6、激活的肥大细胞能够抑制活化的Th2细胞凋亡
　　 通过将抗原特异性的Th2细胞（经CFSE标记）和经OVA特异性IgE致敏的肥大细胞通过尾静脉过继转移给W/Wv小鼠，并经特异性抗原OVA激发。实验结果显示，在未经特异性抗原OVA激发组小鼠肠道中，有4.36％的CFSE阳性Th2细胞发生凋亡，而在过继转移了OVA特异性Th2细胞和OVA特异性IgE致敏的肥大细胞并经特异性抗原OVA激发组小鼠肠道中，CFSE阳性Th2细胞发生凋亡比率为6.53％，和未激发组相比稍微增高。但在过继转移了OVA特异性Th2细胞和未经特异性抗原OVA致敏的肥大细胞组小鼠肠道中，抗原特异性Th2细胞凋亡比率明显增加。这一结果表明，抗原特异性的IgE致敏的肥大细胞能够抑制抗原特异性的Th2细胞凋亡。
　　 7、激活的肥大细胞能够使极化的Th2细胞转变为Tregs
　　 在收集的CFSE阳性Th2细胞（过继转移的Th2细胞）中，只过继转移Th2细胞组，Foxp3阳性T细胞比率只有1.44％，而在过继转移了Th2细胞和特异性IgE致敏的肥大细胞组中，Foxp3阳性T细胞比率达到18.8％，但在过继转移了Th2和未致敏肥大细胞组，Foxp3阳性T细胞比率为1.13％。进一步分析在过继转移了Th2细胞和特异性IgE致敏的肥大细胞组中，Foxp3阳性细胞表达高水平的TGF-β和少量的Th2型细胞因子。在过继转移了OVA特异性Th2细胞和OVA特异性IgE致敏的肥大细胞并经特异性抗原OVA激发组小鼠组肠道中，可观察到Foxp3和CFSE双阳性细胞。这一结果表明，当暴露于激活的肥大细胞时，有一部分Th2效应性T细胞转变为了Tregs。
　　 8、Bcl-6能够抑制GATA3的表达从而促进Th2细胞中Foxp3的表达
　　 在未与肥大细胞共培养组，细胞表达高水平的GATA3，而经OVA特异性IgE抗体致敏的肥大细胞共培养后，细胞中GATA3表达被明显抑制。在与OVA特异性IgE抗体未致敏的肥大细胞共培养组，和经DNP-IgE致敏的肥大细胞共培养组中，细胞均表达高水平的GATA3。另外，Th2细胞中的Foxp3表达量与GATA3表达明显呈负相关。而在Bcl-6阻断的Th2细胞与致敏的肥大细胞共培养时，Th2表达低水平的Foxp3和高水平的GATA3。本结果表明，激活的肥大细胞能够上调Th2细胞中Bcl-6的表达，进一步抑制GATA3的表达，从而使Foxp3表达增加。
　　 9、诱导产生的Tregs具有免疫抑制功能
　　 我们从上述实验中纯化了CD4+CD25+TGF-β+Tregs和极化的Th2细胞（经CFSE标记）。加入抗CD3和抗CD28抗体，常规培养两种细胞3天，流式细胞仪分析。结果显示，在未加入Tregs时，极化的CD4阳性T细胞明显的增殖，且细胞培养液中Th2型细胞因子表达量明显增加，而在与Tregs共培养时，T细胞增殖及其Th2型细胞因子表达均被抑制。这一结果表明，转变而来的Tregs具有免疫抑制功能。
　　 结论：
　　 1、食物过敏的发病机制仍不清楚。本研究首次揭示半抗原是食物过敏发病中潜在的环境诱导因素之一。
　　 2、本研究通过给予小鼠半抗原TNBS和食物抗原OVA建立了一个小鼠食物过敏模型。
　　 3、TNBS能够诱导肠道黏膜DC细胞表达TIM4，而后者和CD4+T细胞上的TIM1相互作用，从而诱导肠道极化的Th2反应。
　　 4、本研究国际上首次发现肥大细胞也具有免疫抑制功能并参与对急性过敏反应自我限制的调控。
　　 5、阐明了肥大细胞对Th2型过敏反应调控的分子机制，即激活的肥大细胞能够诱导Th2细胞表达Bcl-6，表达的Bcl-6能够抑制Th2细胞的增殖及细胞因子的表达，并使其进一步转变为Treg细胞。
　　 6、研究首次发现了另一种新的途径来诱导Tregs的产生，即激活的肥大细胞诱导抗原特异性的Th2细胞产生Tregs。并进一步证明了辅助性T细胞具有可塑性的特点。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

第一部分 半抗原在食物过敏发病机制中的作用

材料与方法

结果

讨论

第二部分 激活的肥大细胞对Th2型食物过敏反应的抑制作用

材料与方法

结果

讨论

第三部分 激活的肥大细胞对食物抗原特异性Th2细胞中Bcl-6表达的影响及其机制

材料与方法

结果

讨论

第四部分 激活的肥大细胞对极化的抗原特异性Th2细胞转归的影响

材料与方法

结果

讨论

第五部分 激活的肥大细胞促进抗原特异性Th2细胞转变为Treg的分子机制

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢