食物过敏原诱导小鼠结肠炎发生的分子机制研究

摘要

研究背景：
　　炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组病因尚不十分明确的慢性肠道炎症性疾病，包括克罗恩病（ Crohn’s disease, CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）。近年来，随着其发病率的不断增高，IBD成为国内外研究的热点之一。研究表明遗传因素、异常免疫反应、感染等因素都与IBD的发病有关，也有人提出摄入的食物与IBD的发生相关，但其确切发病机制尚不清楚。IBD根据其发病的免疫特征可分为为Th(T-helper)1型免疫应答和Th2型免疫应答，目前认为CD是Th1相关的炎症反应性疾病，而UC则是以Th2型免疫应答为主的炎症损伤，主要表现为Th2细胞及其分泌的相关细胞因子增多。食物过敏（food allergy, FA）是指致敏性食物抗原打破机体免疫耐受而诱发的肠道异常免疫反应，近年来呈逐渐上升的趋势。它是以Th2型免疫应答为主，同时产生食物过敏原特异性IgE抗体。一些临床研究发现食物过敏与IBD的发生相关，然而具体机制还未完全阐明。
　　T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain, TIM)4表达于抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC），尤其是成熟的树突状细胞（dendritic cell, DC），近年来发现它是T细胞重要的调节因子，TIM1是其受体，主要存在于T细胞表面，TIM1与TIM4之间的相互作用在诱导Th2免疫应答中起着十分重要的作用。研究表明，TIM4与一些过敏性疾病的发生相关，一些微生物的产物如霍乱毒素（ cholera toxin, CT)可以诱导DC表达TIM4，然而其具体机制尚不明确，是否TIM4诱导的Th2免疫应答反应在IBD的发病机制中起重要作用，仍不十分清楚。
　　组蛋白的乙酰化修饰与许多疾病致病基因的激活和转录有关，分别由组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferases, HATs）和组蛋白去乙酰基酶（histone deacetylases, HDAC）催化完成。其中腺病毒E1A结合蛋白p300是HATs的主要成员，可调节基因的转录，与过敏性疾病相关。研究发现p300可诱导Th2极化，而信号转导子和转录激活因子（Signal Transducer and Activator of Transcription， STAT）6是诱导Th2细胞分化的主要调控因子，在白细胞介素（interleukin, IL）-4存在情况下，STAT6可以募集p300与核受体辅激活蛋白-1（nuclear receptor coactivator, NCOA-1）来激活信号转导。是否p300通过激活STAT6调节TIM4的基因转录，进而诱导Th2极化促进食物过敏及相关结肠炎发生仍需进一步阐明。
　　免疫球蛋白IgE在I型超敏反应中起着十分重要的作用，例如过敏性哮喘、食物过敏及过敏性皮炎等。食物过敏小鼠体内可发现血清总IgE及血清与肠黏膜食物抗原特异性IgE的增高，一些临床证据也发现某些IBD病人血清及肠黏膜IgE是增高的，然而具体诱导IgE增高的机制仍不明了。研究发现人类B细胞淋巴瘤蛋白-6(B cell lymphoma6 protein, Bcl-6)作为一种序列特异性转录抑制因子可以控制B细胞生发中心和抑制IgE转化，Bcl6可以利用HDAC7通过启动子位点的染色质重塑来行使转录抑制作用。是否HDAC7通过调节Bcl6基因从而诱导gE的表达，促进食物过敏及相关结肠炎的发生，有待进一步研究。
　　综上所述，食物过敏与IBD发生的关系仍需进一步阐明。Th2型IBD的发病机制仍不十分清楚，TIM4与IgE在食物过敏及其相关的结肠炎中发挥着重要作用，诱导TIM4与IgE表达的机分子机制仍需进一步研究。本研究中，我们将首先应用霍乱毒素（cholera toxin, CT）与卵清蛋白（ovalbumin, OVA）建立食物过敏原相关的结肠炎模型，初步探讨TIM4在其中发挥的作用，进一步评价模型小鼠肠道中极化的Th2型炎症反应并证实食物过敏可能是IBD发生的一个因素。然后以食物过敏原诱导的小鼠结肠炎模型为研究基础，应用染色质免疫沉淀法（ Chromatin immunoprecipitation, ChIP）及RNAi技术来研究p300在TIM4及STAT6染色质位点重塑中的作用，并采用BALB/c CD45.1与BALB/c CD45.2小鼠，利用骨髓来源树突状细胞过继转移的方法，进一步研究STAT6在CT诱导DC表达TIM4中的作用。同时在体外采用细胞学实验进一步证实了B细胞内HDAC7通过抑制Bcl-6基因，进而促进B细胞表达IgE，诱导食物过敏原相关结肠炎发生的分子机制。
　　研究目的：
　　1.应用CT与OVA建立食物过敏原相关的结肠炎模型，初步探讨TIM4在其中发挥的作用，并进一步证实食物过敏是IBD发生的一个因素。
　　2.应用ChIP及RNAi研究p300与STAT6在TIM4启动子位点染色质重塑中的作用，进一步阐明p300可调节TIM4基因转录。
　　3.利用骨髓来源树突状细胞过继转移的方法，研究STAT6在CT诱导DC表达TIM4中的作用。
　　4.证实B细胞内HDAC7通过抑制Bcl-6基因表达，进而促进B细胞表达IgE，诱导食物过敏相关结肠炎发生的分子机制。
　　研究方法：
　　1.食物过敏原诱导小鼠结肠炎模型的建立
　　雄性BALB/c小鼠(6-8周)，每组12只，将OVA(1mg/鼠)和CT(5μg/鼠)溶于0.1ml生理盐水中，在第0、3天皮下注射致敏，于第5、7、9、11、13、15天给予OVA(1mg/鼠)和（或）CT（20μg/鼠）溶于0.1ml生理盐水中灌肠进行激发，同时给予生理盐水灌肠作为对照，于第17天同时处死对照组与实验组小鼠，取结肠组织进行下一步分析。
　　2.结肠组织病理学检查
　　取小鼠结肠组织，制备石蜡切片，苏木精一伊红(HE)染色，观察肠黏膜损伤情况，进行结肠组织学损伤指数评分评估结肠黏膜组织损伤情况。组织学损伤程度根据病变深度与隐窝破坏程度评分。
　　3.髓过氧化物酶（MPO）检测
　　取病变处结肠10mg，按体积比1:4加入0.1％乙基苯基聚乙二醇，超声匀浆结肠组织，4℃离心5min，取上清。按照MPO试剂盒说明书进行操作，用化学比色法测定结肠组织MPO的活性。在460nm处观察记录吸光度的变化（OD值）。MPO活力计算公式为：MPO活力=(实验OD值-对照OD值)/0.1131。
　　4. CD4+T细胞分离及检测
　　无菌条件下取小鼠结肠组织，将结肠组织剪成lcm大小，加入预消化液预消化30min，重复两次以上。100μm细胞筛过滤后将剩余肠组织切成lmm左右的碎片，PBS清洗一次离心后，加入消化液消化30min；漩涡混匀器剧烈晃动20s，40μm滤网过滤结肠组织，然后用40/80Percoll分离得到小鼠肠道黏膜固有层单个核细胞（LPMC），接着再用免疫磁珠法（MACS）进一步分选。将免疫磁珠法分选出的CD4+T细胞与DC细胞共培养，并加入不同种类的抗原刺激72小时后收集并计数细胞，将荧光染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰（CFSE）加入已经计数好的1×106细胞中使终浓度为10μM，避光染色5分钟后用预冷的PBS洗涤1次，再用细胞培养基洗涤2次后，1500rpm离心5分钟后弃上清，FCM检测。
　　5. Ussing chamber
　　将肠黏膜组织安装到Ussing chamber仪器上，记录仪器运行30分钟后的短路电流，根据欧姆定律算出电阻值，进一步计算出电导值。然后加入不同浓度的CT进行刺激，观察与记录短路电流与电导的变化，另外在结肠黏膜侧加入FITC标记的OVA，在不同时间段用免疫荧光仪检测浆膜侧OVA的荧光量进而计算出OVA的渗出量。
　　6.骨髓来源树突状细胞(BMDC)的分离及培养
　　颈椎脱位法处死小鼠后，无菌条件下分离出小鼠的胫骨和股骨，剪掉其远端，用灭菌注射器抽取PBS，插入骨髓腔反复冲洗直至髓腔变白，收集骨髓悬液，用200目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织，离心弃上清后加入1×氯化铵红细胞裂解液室温孵育3-5 min后离心弃上清得到骨髓细胞。调整细胞浓度为0.5-1×106/ml，均匀铺至24孔培养板内，同时加入重组小鼠 GM-CSF（25 ng/ml）和IL-4（10 ng/ml），37℃，5%CO2培养箱培养48小时，然后吸取悬浮细胞及培养基，贴壁的为BMDC，加入新鲜培养基及细胞因子继续培养，隔日3/4换液并补足相应细胞因子。培养后的BMDC经台盼蓝染色检测细胞活力，流式细胞仪检测纯度。
　　7. ELISA检测
　　OVA特异性IgE、肠黏膜总IgE、IL-4、IL-17、TNF-α与IFN-γ细胞因子的检测完全按照ELISA试剂盒说明书进行，终止反应后，15分钟内在酶标仪450 nm处读出吸光度值，减去空白值即为所得吸光度值，根据标准曲线得到样品中蛋白表达浓度。
　　8.流式细胞术
　　收集培养细胞并计数，每1×106个细胞内加入流式缓冲液Ⅱ（500mlPBS，0.5g BSA，0.25gNaN3）1ml离心（4℃，800g，8分钟）洗涤3次；加入荧光标记的表面分子抗体，4℃避光静置30分钟；然后加入流式缓冲液II离心（4℃，800g，8分钟）洗涤2次后，弃缓冲洗液，再加入300μL流式缓冲液II重悬细胞，振荡混匀，将细胞悬液用40μm滤网过滤后流式细胞仪进行下一步分析。
　　9.实时荧光定量PCR（RT-qPCR）
　　收集培养细胞并计数，1500rpm离心后，1×PBS清洗两次，离心得到细胞沉淀，用Trizol法提取细胞总RNA，所提取的总RNA用紫外分光光度计计算浓度，琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。将25ng cDNA加入10μL iQTMSYBRGreen Supermix中，上下游引物各300nM，进行PCR扩增40个循环。所有实验均重复三次，阴性对照采用未转录RNA作为模版或不加入模版作为对照。β-actin作为内参，最后结果采用2—△△Ct计算。
　　10. Western Blotting
　　收集组织或细胞，加入裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂提取总蛋白，制胶，上样，用SDS-PGAE法分离条带，将分离胶进行转膜到PVDF膜上，5％的BSA室温封闭1小时；洗膜后，加入一抗4℃摇床过夜，再次清洗后加入二抗室温摇床孵育1小时，洗膜后，曝光。
　　11. TIM4启动子报告基因电转染和荧光素酶检测
　　TIM4启动子报告基因由Promega公司构建，按照说明书用Gene Pulser II仪将基因电转移入DC内，同时加入CT刺激继续培养48h后用Dual荧光报告基因检测系统检测荧光素酶活性。
　　12.染色质免疫沉淀法（ChIP）
　　收集细胞，加入1%甲醛交联15分钟，离心后，向细胞沉淀中加入室温SDS裂解液和蛋白酶抑制剂裂解细胞。然后在冰上超声样品，超声之后，离心裂解的产物收集上清液。加入上清液、ChIP稀释液与ProteinG Agarose，4℃旋转混匀60min。静置2分钟后，4℃，5000g离心1min。取上清液10μL作为input，将其余上清液转移置新的EP管，分别加入IP抗体，并设立阴性对照、阳性对照与实验组，4℃，50-100 RPM旋转混匀过夜。孵育结束后，再加入60μL ProteinG Agarose4℃，50-100 RPM旋转孵育60min。静置10min后，4℃，5000g离心1min。去上清，留下沉淀复合物。清洗沉淀复合物，每次5分钟。将沉淀复合物与input中分别加入40μL包含1μL蛋白激酶K的DNA释放缓冲液，轻轻混匀，65℃水浴锅处理15min。利用Promega回收试剂盒回收DNA片段用于PCR扩增。
　　13. RNA干扰（RNAi）
　　包含小鼠p300，STAT6、HDAC7和Bcl-6的shRNA和对照shRNA慢病毒载体由Santa Cruz公司设计和构建，并按照慢病毒载体操作说明转染细胞。用Lenti-X GoStix鉴定病毒产物；然后用病毒产物转导靶细胞，经Western Blotting检测转染效率。基因抑制效率在转染后48小时达到90％，而对照组shRNA无基因抑制作用。
　　14.分离CD45.2小鼠的BMDCs进行过继转移
　　实验小鼠分组，每组6只。野生型CD45.2+DCs组（提取野生型BALB/cCD45.2小鼠的BMDCs，以1×106细胞/鼠尾静脉注射入BALB/cCD45.1小鼠体内）；CD45.2+STAT6?DCs组（对BALB/cCD45.2小鼠的BMDCs进行STAT6基因抑制后，以1×106细胞/鼠尾静脉注射入BALB/cCD45.1小鼠体内）；CD45.2+对照shRNA DCs组（对BALB/cCD45.2小鼠的BMDCs进行空载体转染后，以1×106细胞/鼠尾静脉注射入BALB/cCD45.1小鼠体内），分离LPMC进行流式细胞术检测。
　　15.小鼠脾脏B细胞分离与检测
　　无菌条件下取小鼠脾脏，常规进行脾脏淋巴细胞分离，然后按照小鼠脾脏B细胞分离试剂盒说明书用MACS法进一步分离小鼠脾脏B细胞，计数B细胞，并标记FITC-CD19，流式检验分选纯度(≥95％)。
　　16.统计分析
　　所有数据均用均数±标准差(-x±s)表示，实验均进行三次重复，两组样本均数比较采用t检验，多组样本均数比较采用方差分析(ANOVA)， P<0.05表示差异具有统计学意义，P<0.01表示具有显著差异。
　　结果：
　　1.食物过敏原诱导的小鼠结肠炎模型以Th2免疫应答为主
　　用食物过敏原OVA及免疫佐剂CT诱导出了食物过敏相关的结肠炎模型。小鼠的体重于灌肠之日起急剧下降，灌肠3次后体重下降最多，之后趋于平稳。HE染色发现对照组小鼠的结肠结构完整，而实验组小鼠的结肠组织出现黏膜水肿，隐窝变形，肠壁增厚及大量炎症细胞浸润的表现。与对照组相比，实验组组织学评分明显增高，且差异有统计学意义（P<0.01）。我们用MPO检测试剂盒与ELISA试剂盒分别对两组小鼠的结肠组织提取蛋白进行MPO活性及IL-4、TNF-α、IFN-γ、IL-17四种炎症因子进行检测，发现与对照组相比，OVA/CT组小鼠MPO活性明显增高，且差异具有统计学意义（P<0.01）。肠黏膜分泌的细胞因子IFN-γ及IL-17在OVA/CT组与对照组无明显差异。而IL-4在OVA/CT组较对照组明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。发现与正常对照组相比，实验组小鼠sIgE的表达明显升高。将CD4+T细胞用CFSE标记后，加入不同抗原刺激后与DC共培养3天，用流式细胞术分析发现OVA刺激组小鼠肠黏膜CD4+T细胞与对照组BSA相比明显增殖，差异有统计学意义（P<0.01）。说明食物过敏原诱导的结肠炎小鼠肠道中出现OVA特异性CD4+T细胞的明显增殖。结合肠黏膜组织表达IL-4明显增高，表明OVA/CT诱导的结肠炎症反应是以Th2免疫应答为主。
　　2. CT通过损伤上皮屏障功能促进食物过敏原诱导肠道免疫应答
　　将分离的结肠组织置于Ussing chamber仪器上，发现与结肠炎组相比，对照组结肠组织随着CT浓度的增高，短路电流Isc及电导Conductance逐渐增高，且呈剂量依赖性增长，当CT浓度达到100μg/ml时，与结肠炎组肠黏膜屏障的短路电流及电导变化一致；随着时间的推移及CT浓度的增高，OVA穿过肠上皮的流量递增，当CT浓度达到100μg/ml时，与结肠炎组通过OVA的流量一致，说明OVA的流量成时间和剂量依赖关系。表明给予CT刺激后可以损伤结肠上皮屏障功能，促进食物抗原的吸收。
　　3.食物过敏相关的结肠炎小鼠肠道表达TIM4的DC细胞增多了
　　流式细胞术分析结果发现，对正常对照组相比，实验小鼠结肠黏膜组织表达TIM4的DC细胞数明显升高，且差异具有统计学意义（P<0.01）。为了进一步评估是否细菌产物CT在其中起了十分重要的作用，我们将BALB/c小鼠的BMDC分离出来，在体外用不同浓度的CT进行刺激，并用Real time-qPCR及Western Blotting进行检测后发现随着CT浓度的增高，DC表达的TIM4在mRNA与蛋白水平均呈现增高趋势,且与正常对照组相比，差异具有统计意义（P<0.01）。结果表明CT可促进肠道DC表达TIM4。
　　4.食物过敏原诱导的结肠炎小鼠肠道DC中p300与TIM4的表达均增高
　　我们评估了食物过敏原诱导的结肠炎小鼠肠道DCs中p300与TIM4的表达水平。用RT-qPCR检测结果发现与生理盐水对照组p300和TIM4在mRNA水平的表达相比，从OVA+CT组与单纯CT组灌肠小鼠结肠黏膜组织分离出的DCs中p300与TIM4的表达明显增高，Western Blotting在蛋白水平检测呈现与mRNA水平一致性。结果表明在肠道过敏条件下，肠道DCs可高表达p300与TIM4。而且，我们发现单纯CT灌肠组小鼠的肠道DCs表达的TIM4与p300的水平与OVA+CT组一致，结果提示CT在肠道DC表达p300与TIM4中起重要作用。
　　5. p300介导CT诱导DC表达TIM4
　　野生型BMDC加入CT刺激48h后，TIM4在mRNA水平的表达较生理盐水组明显升高（P<0.01）。同时，我们用Western Blotting检测了DCs在蛋白水平对TIM4的表达，发现加入CT刺激的野生型BMDC及转入空载体的BMDC与生理盐水组相比，TIM4的表达是明显升高的，表明在体外CT可诱导DCs表达TIM4。而加入p300的抑制剂及应用p300基因抑制的DCs，同样加入CT刺激，DC对TIM4的表达却没有变化。这说明了p300可能与CT诱导DCs表达TIM4相关。接下来我们将携带TIM4启动子序列的荧光素酶报告基因转染DCs，然后用CT刺激48h，结果发现转入TIM4启动子序列DCs中检测到了高的荧光素酶活性，而加入p300抑制剂后荧光素酶活性却没有升高。我们进一步用Western Blotting检测了DCs中TIM4蛋白的表达，发现TIM4在蛋白水平的表达与荧光素酶活性呈现一致性。结果证实了p300介导CT诱导TIM4的表达。
　　6. p300在CT介导的TIM4启动子位点染色质重塑中起作用
　　用ChIP分析p300在TIM4启动子位点染色质重塑中的作用，发现与生理盐水组相比，食物过敏原诱导的结肠炎小鼠组（OVA+CT）及单纯CT灌肠组小鼠肠道DCs中TIM4启动位点的p300、H3K4ac、RNA聚合酶II(PolⅡ)及 pSTAT6水平均增高了，差异具有统计学意义（P<0.01）。为了进一步在体外实验中验证这一结果，我们用CT分别刺激野生型DCs与p300基因抑制的DCs48h，ChIP分析发现，与生理盐水组相比，CT刺激后野生型的BMDC细胞内的pp300、H3K4ac、Pol II及pSTAT6水平均增高了，差异具有统计学意义（P<0.01）。且p300基因抑制后的DCs（p300-d）及转入对照shRNA的DCs同时用CT刺激后，p300基因抑制后的DCs（p300-d）组TIM4启动子位点pp300、H3K4ac及RNA Pol II表达水平较生理盐水刺激组无明显变化，说明p300基因抑制后，TIM4启动子位点染色质的重塑也终止了。
　　7. p300在DCs表达STAT6中起重要作用
　　为了检测p300在活化STAT6中的作用，我们在培养基中加入了p300的抑制剂garcinol,结果发现p300与STAT6的mRNA水平被终止了。而在培养基中加入STAT6的抑制剂，p300的mRNA仍是增高的，而STAT6的mRNA水平被终止了，可见在DCs中p300影响STAT6的表达。同时我们用ChIP检测DCs中在STAT6启动子位点pp300, H3K4ac, PolⅡ和核受体辅激活蛋白1(NCOA1)的表达情况，发现随着CT浓度的增高它们的表达也增高了，与生理盐水组相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。加入p300抑制剂后，四者表达均降低，而加入STAT6抑制剂后，仅出现NCOA1的降低。为了进一步证实是否在DCs中NCOA1是STAT6的转录协同刺激因子，我们抑制了DCs中的NCOA1基因,然后用CT刺激NCOA1缺失的DCs，同时刺激转入空载体的DCs作为对照，我们发现用CT刺激后，DCs中在STAT6启动子位点p300,pp300, H3K4ac和PolⅡ的表达仍是升高的，且差异具有统计学意义（P<0.01），而STAT6却没有表达，进而证实了NCOA1是DCs中STAT6的转录协同刺激因子。
　　8. STAT6介导CT诱导TIM4的表达
　　从BALB/c CD45.2小鼠中提取BMDCs，用RNAi抑制CD45.2+DCs中STAT6的基因,然后将它们过继转移给BALB/cCD45.1小鼠。给予BALB/cCD45.1小鼠10μg/mlCT连续灌肠4天，于第5天处死小鼠，分离肠道LPMC进行流式分析。结果发现TIM4+CD45.2+STAT6?DCs的数量很少，仅有0.49%，而32.7%的TIM4+DCs在CD45.2+STAT6+DCs被检测到了。为了进一步验证这个结果，我们用MACS从CD45.1小鼠体内分离出CD45.2+DCs，然后分别用RT-qPCR和Western Blotting检测TIM4的表达。结果发现与STAT6?CD45.2+DCs中TIM4的表达相比， STAT6+CD45.2+DCs中，TIM4的表达明显增高,差异具有统计学意义(P<0.01)，表明STAT6介导DCs中TIM4的表达。
　　9. CT通过增加B细胞内HDAC7抑制Bcl6表达
　　我们在培养基中用CT刺激IL-6激化的B细胞，结果表明用CT刺激后，Bcl6的水平在mRNA和蛋白水平均降低了，且呈剂量依赖的关系，与培养基对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明CT可以抑制B细胞对Bcl-6的表达。RT-qPCR结果表明用CT刺激B细胞后，HDAC的活性增高了，其中以HDAC7的活性增高最为显著。我们用不同浓度的CT刺激IL-6预先处理的B细胞48h，提取细胞总蛋白行Western Blotting分析。结果表明CT增加了B细胞内HDAC7的表达，而且HDAC7的表达与CT呈剂量依赖关系。结果暗示了HDAC7的增高可能与B细胞内CT调节Bcl6相关。
　　10. HDAC7在B细胞内Bcl6启动子位点染色质重塑中起作用
　　我们进一步观察了B细胞内Bcl6启动子位点染色质的改变。在体外用CT刺激B细胞6h后，ChIP分析发现Bcl6启动子位点pHDAC7、组蛋白3的第9位氨基酸甲基化（H3K9me）和H3K27me的表达水平均增高，而Pol II和STAT3(Bcl6的转录调节因子)的表达却被抑制了。考虑到HDAC7可能是CT诱导Bcl6启动子位点改变的关键因素，我们将B细胞内的HDAC7抑制，用CT刺激转入HDAC7 shRNA的B细胞6h。结果发现CT诱导的Bcl-6启动子位点染色质重塑终止了。表明CT可以增加B细胞内HDAC7的表达，HDAC7的表达又可以在Bcl6启动子位点增加H3K9me和H3K27me的表达，抑制 Pol II和STAT3。我们用IL-6与CT共同刺激B细胞48h后，将细胞总RNA与蛋白提取出来，分别进行 RT-qPCR与Western Blotting分析。结果发现加入CT后无论从mRNA水平还是蛋白水平B细胞内IL-6诱导的Bcl-6的表达均被抑制了。
　　11. CT通过抑制B细胞内的Bcl6基因诱导IgE的表达
　　我们用CT刺激抑制和没有抑制Bcl6基因的B细胞4天，用RT-qPCR及Western Blotting从mRNA及蛋白水平观察IgE的表达。发现在Th2极化条件下（加入IL-4共培养）下，CT刺激B细胞表达高水平的IgE，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01），而单独给予CT或IL-4并没有出现这种情况。为了进一步验证抑制Bcl-6基因可以促进IgE的表达，我们将Bcl-6基因抑制，然后用CT/IL-4分别刺激转入controlshRNA和Bcl6 shRNA的B细胞，发现刺激转入control shRNA的B细胞无论从蛋白水平还是mRNA水平IgE的表达均明显升高，且差异具有统计学意义（P<0.01）；而转入Bcl6 shRNA的B细胞给予刺激后， IgE的表达却没有变化。表明Bcl-6在IgE的表达中起着十分重要的作用。
　　结论：
　　1.首次通过给予小鼠细菌产物CT与食物过敏原OVA灌肠建立了食物过敏原诱导的结肠炎模型，进一步证实食物过敏相关的免疫应答与结肠炎发生的关系。
　　2.发现细菌产物CT诱导肠道DCs表达的TIM4在食物过敏原诱导的肠道炎症中起到重要作用。
　　3.从分子机制上证实了组蛋白乙酰化酶p300在TIM4启动子位点染色质重塑中的作用，在CT刺激下通过调节肠道DCs表达TIM4促进Th2型炎症反应的发生。
　　4.进一步阐明了给予CT刺激后，p300表达的增加可以调节STAT6水平进而促进DC对TIM4表达的分子机制。
　　5.证实CT可以加强B细胞内HDAC7的活性，HDAC7通过调节Bcl6启动子位点染色质重塑从而抑制Bcl-6的表达，诱导B细胞表达IgE进而促进食物过敏原诱导的结肠炎发生。

目录

声明

英文缩略词

前言

第一部分 TIM4在食物过敏原诱导结肠炎中的作用

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 小结

第二部分 组蛋白乙酰转移酶p300介导DC表达TIM4

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三部分 p300通过介导STAT6诱导TIM4的表达

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四部分 HDAC7通过抑制Bcl-6调节B细胞表达IgE

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

结论

本文创新点

参考文献

综述:组蛋白乙酰化修饰在肠道疾病发病机制中的作用研究进展

1 组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶

2 组蛋白乙酰化修饰对免疫细胞的调节功能

3 HATs/HDACs与肠道疾病

4 HATs/HDACs相关药物在肠道炎症与肿瘤中的治疗作用

5 总结与展望

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

个人简历

教育经历

在学期间学术论文发表情况

主持或参与项目情况:

获奖情况：

致谢