氯吡格雷在AOM/DSS诱导的小鼠结肠炎相关肿瘤发生中的作用

摘要

炎性肠病（IBD）是与胃肠道免疫系统失衡相关的慢性炎症，15％左右的IBD患者最终发展为结肠癌，即结肠炎相关结肠癌（CAC）。随着结肠炎的严重程度、损伤范围和患病时长的增加，CAC的发病率显著提高。因此IBD与CAC的形成和发展密切相关，若能有效的控制 IBD的病程发展，就有可能有效降低CAC的发生概率和严重程度。
　　近年来，许多研究发现，血小板在人体内不仅具有凝血修复组织损伤的作用，还可作为固有免疫系统和适应性免疫系统的调节物质，积极参与炎症的形成与发展，与多种炎症和肿瘤的发生、发展密切相关。已有研究证实，血小板在IBD患者体内具有明显变化，如形态学变化，数量增多，颗粒物释放增多等。IBD患者体内血小板处于高激活状态，并具有自发聚集的特点，容易形成血栓栓塞，这也成为患者死亡的四大原因之一。并且血小板的这种变化与疾病的严重程度密切相关，因此血小板的激活状态可能与 IBD的严重程度直接相关，抑制血小板的激活可能影响 IBD的发展进程。临床研究也显示，长期低剂量服用阿司匹林能够延缓肿瘤的发生和发展，并且多数为与炎症相关的肿瘤类型，可能与抗血小板聚集相关，但其具体机制仍不明确。恶性肿瘤患者伴随有血小板数量增多或血小板活性升高的现象，恶性肿瘤可引起血小板的反应性增多，并产生血栓素（TXA2）和腺苷二磷酸（ADP），促进血小板的激活和聚集，即肿瘤诱发的血小板聚集（TCIPA），最终肿瘤细胞在血管内被血小板包被覆盖，从而屏蔽免疫系统监视。血小板内α-颗粒含有多种生长因子，包括PDGF、VEGF等。恶性肿瘤可促进血小板发生脱颗粒，释放出多种生长因子，促进肿瘤细胞的生长和血管新生。此外，血小板还可以促进肿瘤的侵袭和转移。因此血小板对于肿瘤的发生和发展也有重要的促进作用。
　　综上所述，血小板的激活与聚集水平与 IBD和肿瘤的发生与发展都密切相关，高度激活和聚集的血小板能够促进 IBD和肿瘤的形成与发展，而长期反复的IBD又大大增加了CAC肿瘤的发生概率。因此我们猜想，采用抗血小板聚集药物是否能够延缓IBD的发生和发展，进而影响CAC的形成和发展呢？为了解决这一疑问，我们利用新一代抗血小板聚集药物氯吡格雷，应用于实验性小鼠结肠炎相关结肠癌模型，以期评价抗血小板聚集药物对结肠炎相关性肿瘤发生的可能作用，并对其可能的作用机制进行研究。
　　实验方法：通过联合应用化学致癌剂氧化偶氮甲烷（AOM）与三个循环的致炎剂葡聚糖硫酸钠（DSS）建立小鼠结肠炎相关性结肠癌模型。以给予炎性刺激的第一天计为建模过程的第0天，对小鼠给予不同剂量的氯吡格雷(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)，并对小鼠的体重，临床体征进行记录。在第56天处死小鼠，获取样本，拍照记录，统计肿瘤的数目和大小。利用苏木素/伊红（HE）染色评价小鼠结肠上皮的异型增生程度。为了探究氯吡格雷发挥对结肠炎相关性结肠癌的抑制作用的可能机制，我们将小鼠CAC肿瘤模型分为早期炎症阶段和后期肿瘤形成与发展阶段。利用首剂AOM和连续给予DSS8天建立结肠炎相关性肿瘤炎症阶段模型，并评价了不同剂量氯吡格雷（1.39mg/kg、4.17mg/kg、12.5mg/kg）对该模型小鼠的体重变化、临床表现、结肠长度、组织病理结构、炎性因子的释放、结肠上皮细胞的增殖情况的作用。在肿瘤形成与发展阶段，即在建模过程的第35天和第56天分别获取小鼠样本，观察了结肠上皮细胞增殖情况（PCNA、Ki67染色）、细胞因子和趋化因子的表达情况（TNF-α、CXCL2&CXCR2、CCL3&CCR1），对氯吡格雷抑制结肠炎相关性肿瘤形成与发展的作用机制进行了初步探索。
　　实验结果：
　　1.氯吡格雷可使CAC模型小鼠第9天相对于初始体重的体重变化率由102.5%升高至106.4%（P＜0.05），减轻CAC模型小鼠第31天和第50天的临床评分，分别由2.5分和4.5分降低至0.85分和2分（均为P＜0.05）。
　　2.对于结肠炎相关性结肠癌肿瘤的形成情况，氯吡格雷具有减少肿瘤数量和减轻肿瘤负荷量的趋势，可将肿瘤数量由8个减少至5个，P＞0.05，肿瘤负荷由27.4mm减轻至14.4mm，P＞0.05。氯吡格雷可显著降低肿瘤的大小（由3mm降至2.3mm，P＜0.05）、肿瘤的最大直径（由4.6mm降至3.2mm，P＜0.05）、直径>4mm的肿瘤数占比（由15.4%降至3.0%，P＜0.05）。
　　3.对CAC小鼠结肠组织进行病理切片分析，氯吡格雷可显著降低CAC小鼠结肠上皮异型增生的程度，并且CAC模型小鼠的肿瘤全部为中度和重度异型增生，而氯吡格雷给药组小鼠的肿瘤多为轻度和中度异型增生。
　　4.对CAC模型的炎症期进行分析，发现氯吡格雷可减轻炎症引起的体重变化，可使模型小鼠相对于初始体重的体重变化率由88.97%升高至97.55%，P＜0.01；减轻小鼠的临床评分由4.4分降至2.5分，P＜0.01；降低炎症引起的结肠长度的缩短，由6.2cm延长至7.3cm，P＜0.001。病理切片分析显示，氯吡格雷可显著降低炎性细胞的浸润，减少溃疡的数目和长度，降低上皮的异型增生程度，均为P＜0.05并且氯吡格雷可使小鼠结肠组织的损伤范围由43.6%减少至26.5%，P＜0.001。氯吡格雷还可以降低小鼠结肠组织Ki67的染色范围，P＜0.05。
　　5.对CAC模型的肿瘤形成与发展阶段进行分析，发现氯吡格雷可在模型建立过程中的第35天，降低TNF-α的表达量，由正常小鼠结肠组织的3倍降低至1.5倍，P＜0.01；降低小鼠结肠组织上皮细胞Ki67的染色水平，P＜0.05；氯吡格雷还可以降低趋化中性粒细胞富集的趋化因子及其受体，CXCL2和CXCR2的mRNA表达和蛋白水平，均为P＜0.05。在第56天获得的样本中，氯吡格雷虽然对结肠上皮细胞的Ki67染色水平和TNF-α的表达水平无显著影响，但依然可降低CXCL2和CXCR2的mRNA表达和蛋白水平，均为P＜0.05，并且还可以降低趋化巨噬细胞富集的趋化因子及其受体CCL3和CCR1的表达，均为P＜0.05。
　　结论：
　　1.在CAC肿瘤形成的过程中，氯吡格雷能够抑制肿瘤的大小，抑制直径较大肿瘤的形成，减轻肿瘤的异型增生程度，但由于组内个体差异较大，对肿瘤的数量和负荷量无明显抑制作用。表明氯吡格雷对CAC的形成和发展具有一定的抑制作用。
　　2.在CAC肿瘤形成的早期炎症阶段，氯吡格雷可缓解CAC小鼠炎症期的体重变化率、临床体征、炎性细胞的浸润、溃疡程度和损伤程度，并抑制小鼠结肠上皮细胞的增殖。表明氯吡格雷对CAC形成炎症期的炎症程度具有显著缓解作用
　　3.在CAC肿瘤的形成与发展阶段，氯吡格雷可在模型建立的第35天降低结肠上皮细胞的增殖水平和TNF-α的表达水平，而到模型建立的第56天，氯吡格雷并没有降低结肠上皮细胞的增殖水平和TNF-α的表达水平。表明在模型建立的第35天，氯吡格雷对肿瘤的形成和发展具有显著抑制作用，而到第56天氯吡格雷已不能抑制肿瘤的进一步发展。
　　4.根据CAC肿瘤形成与发展阶段，趋化因子的表达水平和蛋白水平的分析，发现氯吡格雷对CAC肿瘤形成和发展的抑制作用，可能与抑制中性粒细胞在肿瘤局部的趋化和富集相关。
　　综上所述，我们的研究利用实验性动物模型，证实了氯吡格雷对结肠炎相关性结肠癌的形成与发展具有一定的延缓作用，其机制可能与减轻炎症程度、抑制上皮细胞增殖、减少中性粒细胞在肿瘤部位的富集相关。

目录

声明

缩略词表

前言

材料与方法

1. 动物饲养

2. 主要试剂

2.1 建立结肠炎相关结肠癌小鼠模型所需试剂

2.2 药品

2.3 实时荧光定量PCR反应所需试剂

2.4 HE染色及免疫组化所需试剂

2.5 聚合酶链式反应所需试剂

3. 实验方法

3.1 动物模型的建立

3.2 给药方案

3.3 动物模型的评价指标及取材方法

3.4 病理免疫组织化学检测

3.5 实时荧光定量PCR检测

3.6 聚合酶链式反应PCR及其产物鉴定

4 统计分析

实验结果

第一部分 氯吡格雷对AOM/DSS诱导的小鼠CAC肿瘤形成与发展的影响

1.1 AOM/DSS诱导的小鼠CAC模型的建立

1.2 氯吡格雷对AOM/DSS诱导的CAC小鼠体重变化和临床评分的影响

1.3 氯吡格雷对AOM/DSS诱导的CAC小鼠肿瘤发生数目和大小的影响

1.4 氯吡格雷对AOM/DSS诱导的CAC小鼠结肠组织异型性的影响

第二部分 氯吡格雷延缓AOM/DSS诱导的小鼠CAC肿瘤发展的可能机制

2.1 氯吡格雷对AOM/DSS模型小鼠早期炎症阶段相关因素的影响

2.2 氯吡格雷对AOM/DSS模型小鼠肿瘤形成与发展阶段相关因素的影响

讨论

结论

参考文献

个人简历

致谢