戊乙奎醚对内毒素致新生大鼠急性肺损伤时HIF-1α表达的影响

摘要

急性肺损伤(acutelunginjury，ALI)是由于败血症、肺炎、吸入胃肠道内容物，外伤和其他一些临床疾病引起的肺实质病变，导致的急性低氧性呼吸功能不全，可起病于任何年龄的患者。病情严重的急性肺损伤可进一步发展，成为急性呼吸窘迫综合症（ARDS），甚至演变成为多器官功能障碍综合征(MODS)，急性肺损伤的病死率高达44％以上。新生儿由于肺组织发育不成熟，对外界损伤刺激抵御能力差。新生儿期由于重症感染、损伤，临床表现为进行性呼吸困难、肺部湿哕音、咳出粉红色泡沫痰，新生儿由于肺血管基膜结构较薄，易引发肺出血，后果更加严重。所以对新生儿急性肺损伤预防的研究具有重要的临床意义。目前，有国外学者发现，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在急性肺损伤的发病过程中起到了重要的作用。本研究拟通过内毒素(LPS)腹腔注射给药的方法，制作新生大鼠急性肺损伤的动物模型，并通过盐酸戊乙奎醚(penehyclidinehydrochloride，PHC)在内毒素腹腔注射给药前进行干预处理，观察其对相关介质的影响作用，并通过对肺组织病理学的观察，探讨盐酸戊乙奎醚在急性肺损伤新生大鼠中的保护作用机制，以及该保护作用与缺氧诱导因子-1α表达的关系。为新生儿ALI的临床防治提供新的理论依据。
　　 目的：
　　 探讨盐酸戊乙奎醚对内毒素(LPS)致急性肺损伤（ALI）新生大鼠的保护作用以及该保护作用与缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的关系。为新生儿急性肺损伤的临床防治提供新的理论依据。
　　 材料与方法：
　　 1.研究对象
　　 24只健康7日龄新生SD大鼠，体重17～22g，雌雄不拘，购买于郑州大学医学院河南省实验动物中心。
　　 2.实验方法
　　 2.1、动物模型的制作
　　 采取腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的造模方法，制作新生大鼠内毒素致急性肺损伤的动物模型。把LPS稀释，以3mg/kg的剂量，以1ml注射器下腹部腹腔注射。注射后将大鼠放回笼内，在LPS注射后6小时，将各组动物用350mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉后，开胸采取肺组织标本。依据光镜下肺组织病理学的改变以及炎症指标，可对新生大鼠ALI动物模型的成功建立进行确定。
　　 2.2、动物分组
　　 将24只健康7日龄SD大鼠，采用随机数字表法分为三组(n=8):①空白对照组（C组），腹腔注射生理盐水0.3ml②肺损伤组(ALI组)，依LPS3mg/kg的剂量稀释至0.3ml腹腔注射③盐酸戊乙奎醚组（P组），在注射3mg/kgLPS0.3ml前半个小时，腹腔注射盐酸戊乙奎醚2mg/kg。
　　 2.3、肺组织的标本采集
　　 将左肺组织电子称重记录湿重后置于70℃烘箱72小时烘干，用于测量湿/干重比值。将右肺上叶用DEPC水冲洗干净后，放置冻存管封存，放置至-80冰箱保存，待用于RT-PCR检测。将右肺后叶置入4％甲醛溶液内浸泡24小时，进行固定。将固定好的肺组织进行石蜡包埋、切片，并用不同浓度酒精进行梯度脱水，待用做HE染色光镜观察。将右肺下叶取出，制成匀浆液，通过在4℃电子离心机中经过15分钟1800r/min转速离心后，取其上清液，置于-20℃冰箱保存，备以组织匀浆检测用。
　　 2.4、检测指标
　　 2.4.1、ELISA法测定新生大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、HIF-1α的含量
　　 将新生大鼠右肺下叶取出电子称重，按其质量9倍的容积取生理盐水置入匀浆器中，制成匀浆液，通过在4℃电子离心机中经过15分钟1800r/min转速离心后，取其上清液，制备组织匀浆。用ELISA试剂盒检测肺组织匀浆中IL-6、TNF-α、HIF-1α的含量。
　　 2.4.2、RT-PCR法测定新生大鼠肺组织中HIF-1αmRNA的表达
　　 将右肺上叶用DEPC水冲洗干净滤纸吸干后，快速经液氮冷却。经过HIF-1α、GAPDHmRNA引物的设计与合成、提取大鼠肺组织总RNA、RNA逆转录、PCR扩增HIF-1α、GAPDH以及琼脂糖凝胶电泳后检测新生大鼠肺组织中HIF-1αmRNA的表达变化。
　　 2.4.3、测定新生大鼠肺组织湿/干重比值(W/D)
　　 将左肺组织，滤纸吸干其水分，经电子称重后记录湿重值，然后置于70℃恒温烘干箱烘烤72小时，使肺组织干重的质量不再发生变化。测定并记录肺脏干重，计算出肺湿/干重比值(W/D)。
　　 2.4.4、新生大鼠肺组织学检查
　　 取右肿后叶制成厚度为5um的石蜡切片，行HE染色。用于光镜下肺组织组织形态变化的观察。
　　 3.统计学处理
　　 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差((x)±s)来表示，使用单因素方差分析进行各组间的比较，使用Student-Newman-Keuls法（q检验）进行均数两两比较。检验水准α=0.05。
　　 结果：
　　 1.新生大鼠的一般情况:在LPS腹腔注射后6小时，急性肺损伤组(ALI组)大鼠相比空白对照组大鼠的活动情况有所减少、并出现了呼吸加速的症状，其中部分新生大鼠咳出了粉红色泡沫状痰并表现出紫绀现象。盐酸戊乙奎醚组（P组）的新生大鼠同时也出现了呼吸加快、活动减少的表现，但未发现有咳出粉红色泡沫状痰及紫绀的现象。而空白对照组反应正常，未见以上所述症状。
　　 2.新生大鼠肺组织形态学的观察:在光学显微镜下，空白对照组（C组）新生大鼠肺组织结构完整，可观察到正常的肺泡结构、光滑的肺泡壁和均匀的肺泡间隔。急性肺损伤组（ALI组）肺泡壁完整结构破坏，肺泡壁断裂，肺间质弥漫水肿，镜下可见肺泡腔内大量渗出的白细胞和红细胞。盐酸戊乙奎醚组(P组)肺泡结构较为完整、肺间质水肿渗出物较ALI组明显减轻。
　　 3.与空白对照组（C组）比较，急性肺损伤组(ALI组)和盐酸戊乙奎醚组（P组）的新生大鼠肺W/D比值升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与急性肺损伤组（ALI组）比较，盐酸戊乙奎醚组（P组）的新生大鼠肺组织W/D比值降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4.与空白对照组（C组）比较，急性肺损伤组（ALI组）和盐酸戊乙奎醚组（P组）的新生大鼠肺组织IL-6、TNF-α以及HIF-1α的含量升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);与C组比较，急性肺损伤组（ALI组）和盐酸戊乙奎醚组（P组）的肺组织中HIF-1αmRNA的含量明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05);与急性肺损伤组（ALI组）比较，盐酸戊乙奎醚组（P组）的新生大鼠肺组织IL-6含量、TNF-α、HIF-1α和HIF-1αmRNA的表达降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 戊乙奎醚对新生大鼠内毒素性急性肺损伤具有保护作用，其机制可能是通过降低HIF-1α的表达，降低炎症反应程度，从而缓解ALI的病情进展。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学处理

3 结果

3．1 一般情况观察

3．2 测定各组新生大鼠肺湿／干重比值(W／D)

3．3 新生大鼠肺组织病理学变化

3．4 RT-PCR结果

3．5 ELISA法测定肺组织TNF-α、IL-6及HIF-1α的表达

4 讨论

4．1 急性肺损伤的发病机制

4．2 急性肺损伤的药物治疗

4．3 HIF-1α在炎症反应中的作用

5 结论

参考文献

综述

致谢

作者简历及在学期间发表的学术论文