促红素衍生肽ARA290对大鼠移植肾早期损伤的保护作用及机制研究

摘要

随着器官移植领域技术的飞速发展，肾移植成功率不断提高，肾移植已成为治疗终末期肾病(Endstagerenaldisease，ESRD)的有效方法。但临床肾移植过程中，移植肾在切取、灌注、保存等过程中不可避免的要发生一定程度的损伤，其中缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是最重要的，并且在早期移植肾组织活检发现缺血再灌注损伤与促炎症状态有关，与移植物长期存活以及排斥反应的发生有直接的关系。研究证实在I/R中，核因子-κB(NF-κB)的激活起了重要的作用。NF-κB是一种重要的转录因子，研究显示NF-κB广泛参与多种炎性因子基因的转录表达的调控，可导致细胞的过渡活化并诱发损伤。Sung等研究发现在肾脏缺血期NF-κB就被激活，并且在再灌注的15min时达到高峰，NF-κB对组织的早期的炎症起重要作用。
　　近年的研究发现，促红素(Erythropoietin，EPO)除了对造血系统的造血作用外，EPO在各种器官的缺血再灌注损伤中有显著的组织保护作用，包括肾、心脏、肝脏和中枢神经系统等，证实在缺血再灌注前后给予促红素可起到保护作用。在肾脏中，研究发现应用EPO可以减轻肾脏的缺血再灌注损伤，促红素具有很好的抗炎、抗凋亡作用，并且这些保护作用是剂量依赖的，从而对肾脏起到即刻保护作用。EPO保护组织的可能的机制是通过受体与配体结合相互作用的方式来发挥其效用的。在缺血状态下，EPO受体表达将会显著增加。EPO在细胞内可以有多种信号传导途径。已发现EPO可以激活NF-κB，并且目前发现的可能参与EPO组织保护作用的信号分子途径有多种，如PI3/Akt，JAK2及MAPKs等均可引起NF-κB的活化，EPO的受体复合物((erythropoietinreceptro，EPO-R)包括2个经典型的(EPOR)2和2个β型的受体βcR2(β-commonreceptor,βcR)。EPO与传统的EPO同源二聚受体(EPOR)2结合能力要比具有保护性亚单位的EPOR2-βcR2的结合能力强，因此启动组织的保护作用需给予更高剂量的EPO。但高剂量EPO带来的副作用也是很明显的，如心血管事件发生率增加、血栓形成的风险增加、肿瘤细胞的生长等，因此限制了其在临床中对保护组织的广泛应用。MBrines等研究发现在小鼠心肌细胞上存在保护性受体亚单位βcR(CD131)，能与EPO受体亚单位，EPO-R形成异源二聚受体复合物，通过激活不同的信号通路，进而发挥减轻炎性反应、抗细胞调亡，对组织和器官发挥保护作用，但不启动造血信号通路的传导，因此为了避免EPO的不良反应，各种的EPO衍生物研发能独立于促红素的传统的结合位点而和EPOR2-βcR2受体复合物结合发挥组织保护作用。ARA290是最新的EPO类似物衍生肽，含有11种氨基酸序列，在空间上组成线性多肽，能独立于促红作用位点而发挥组织保护作用。目前有少量的研究证实，ARA290在肾、脑缺血再灌注损伤中都有很好的组织保护作用，并且没有高剂量EPO带来的明显的副作用。
　　尽管上述对ARA290的研究已取得初步进展，并且表现出了很好的组织保护作用，但应用ARA290预处理供体供肾并且观察其在移植后移植肾早期损伤中的作用研究尚未见报道。因此本研究拟模拟临床肾移植条件及过程，将ARA290加入UW器官保存液中，在4℃低温保存条件下对供肾进行预处理，并建立异体大鼠肾移植模型，观察移植术后对肾脏的保护作用，应用分子生物学方法检测移植术后移植肾炎性因子mRNA的表达以及可能的NF-κB的信号机制，探讨应用促红素衍生肽ARA290处理肾移植供体，提高供体质量、减轻移植肾早期损伤，从而取得临床上较好的肾移植疗效。
　　第一部分:体外部分促红素衍生肽ARA290对内皮细胞低温缺氧复氧损伤中的保护作用及NF-κB的机制研究
　　目的
　　观察ARA290对人脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)低温缺氧复氧损伤中的保护作用，探讨ARA290预处理内皮细胞保护作用的NF-κB机制。
　　方法
　　1.建立HUVEC细胞低温缺氧复氧模型;并随机分为四组:①对照组(Control):10％FBS的RPMI1640培养液原代培养72小时后，更换不含血清的1640培养液继续培养10小时;②缺氧/复氧组(H/R):10％FBS的RPMI1640培养液原代培养72小时后，更换不含血清的1640培养液低温缺氧保存6h/复氧4小时;③ARA290组:10％FBS的RPMI1640培养液原代培养72小时后，更换经含10nmol/ml的ARA290的UW器官保存液;④UW器官保存液组(UW):10％FBS的RPMI1640培养液原代培养72小时后，更换UW器官保存液并低温缺氧保存6h/复氧4小时。
　　2.MTT比色法检测细胞活力、AnnxeniV/FITC，PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡。
　　3.用RT-PCR技术测定内皮细胞VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、IL-6和MCP-1的mRNA表达。
　　4.用EMSA方法测定各组低温缺氧/复氧损伤后HUVEC细胞NF-κB结合活性。
　　结果
　　1.Control组的细胞存活率为97.3±6.8％，而经低温缺氧复氧损伤后的H/R组细胞存活率明显下降，只有71.4±5.9％，和control组比较(P＜0.01);而经ARA290预处理组的内皮细胞存活率略低于control组，存活率为89.5±7.1％(P＜0.05)，有统计学差异，而显著高于UW组和H/R组(P＜0.01)，统计学有显著差异。UW组内皮细胞存活率为76.3±6.0％与H/R组无差异(P＞0.05)。
　　2.细胞凋亡率H/R组13.13±0.94％、control组1.15±0.18％、ARA290组5.34±0.61％、UW组的11.45±0.71％，ARA290预处理组的细胞凋亡率，和其余三组比较有统计学差异(P＜0.05)。
　　3.RT-PCR结果显示，经ARA290预处理组ICAM-1、VCAM-1、IL-6、MCP-1及P-selectin的mRNA表达与H/R组相比明显下降，分别下降了(65.19±3.18)％、(71.53±5.13)％、(68.53±4.81)％、(51.09±4.17)％、(45.24±3.79)％，差异有显著意义(P＜0.01)，而UW组各组内皮细胞的因子mRNA表达未被抑制，略低于H/R组因子的mRNA表达，两组间比较统计学无差异(P＞0.05);H/R组上述因子mRNA表达与Control组相比，分别上升了（10.58±1.17）倍、（22.03±3.74）倍、(13.29±1.87)倍、（29.13±3.15）倍、（19.15±2.18）倍，统计学上具有显著差异(P＜0.01)。
　　4.NF-κBDNA结合活性EMSA法结果显示:Control组有较弱的表达，RDU为1.20±0.11;H/R组RDU为58.31±5.17，与control组及ARA290组比较有显著差异((P＜0.01)。ARA290预处理组的RDU为8.69±1.14，明显低于UW组的RDU约为50.61±3.73，统计学上有显著差异(P＜0.01)。同时在特异性竞争实验即在H/R组中，加入未标记的特异性探针及未标记非特异性探针SP-1竞争，其RDU值分别为1.55±0.23和54.3±1.60。
　　结论
　　1.在低温缺氧复氧损伤中，HUVEC上调了相关的趋化因子及粘附分子的mRNA表达水平。
　　2.促红素衍生肽ARA290可对HUVEC细胞的低温缺氧复氧损伤有保护作用，可抑制其凋亡，降低了粘附分子及趋化因子的mRNA表达水平。
　　3.促红素衍生肽ARA290预处理可抑制NF-κB的活化。
　　第二部分:在体研究促红素衍生肽ARA290减轻大鼠移植肾早期损伤及机制研究
　　目的
　　探讨应用促红素衍生肽ARA290预处理肾移植供体，提高供体质量、减轻大鼠移植肾早期损伤。
　　方法
　　1.建立大鼠异体肾移植模型，将促红素衍生肽ARA290加入UW器官保存液中对供体器官进行预处理，将大鼠随机分为3组:每组6只:(1)Sham组（假手术组），SD大鼠开腹后，即将伤口缝合，24h后切取左肾;(2)UW组，供肾经UW灌注及低温缺氧保存6h，移植到受体大鼠24h后切取移植肾;(3)ARA290组供肾经含10nmol/Kg的UW低温缺氧保存6h，移植到受体大鼠24h后切取移植肾。
　　2.观察ARA290对移植大鼠肾功能及肾组织形态学的保护作用。
　　3.应用免疫组织化学法观察炎性细胞对移植肾早期的浸润，并观察ARA290对其影响。
　　4.应用分子生物学方法RT-PCR等方法检测移植术后移植肾组织炎性因子ICAM-1、VCAM-1、MCP-1及RANTES的mRNA表达，并观察ARA290对其影响。
　　5应用EMSA法检测NF-κB的DNA结合活性，探讨其保护移植肾早期损伤的可能机制。
　　结果:
　　1.ARA290组的血肌酐值为180.28±32.06μmmol/L，而UW组的为319.48±35.02μmmol/L(P＜0.01)，Sham组的为32.15±7.08μmmol/L，而ARA组则明显低于UW组(P＜0.01);同样，ARA290组尿素氮水平明显低于UW组(19.48±3.81vs.31.19±9.17mmol/L，P＜0.01)，而UW组则明显高于Sham组(31.19±9.17vs.4.21±0.69mmol/L,P＜0.01)
　　2.UW组的移植肾组织受损严重，其主要表现为肾小管结构破坏消失，上皮细胞肿胀、脱落、刷状缘丢失，可见核固缩，肾小管扩张、管腔阻塞，并伴有炎性细胞浸润;经ARA290预处理供体肾脏后，与UW组相比，移植肾的损伤程度则有明显改善;
　　3.UW组可见大量的巨噬细胞在肾小血管间质浸润;而与ARA290组相比，经ARA290处理组则在小管间质区域偶见巨噬细胞，减少了的浸润。
　　4.与Sham组相比，UW组移植肾的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、及RANTES的mRNA水平明显升高(P＜0.05);与UW组和相比，经ARA290处理的移植肾MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、及RANTES的mRNA水平显著下降(P＜0.01)。
　　5.ARA290组NF-κB的DNA结合活性略高于Sham组（1.016±0.28VS0.54±0.30），差异无统计学意义(P＞0.05)，与UW组相比(51.35±3.18VS1.16±0.38)，显著抑制(P＜0.01)。
　　结论:
　　1.促红素衍生肽ARA290对大鼠移植肾具有保护作用，可显著减轻移植肾早期的巨噬细胞在肾小管、间质的浸润，减轻形态学损伤。
　　2.促红素衍生肽ARA290可显著抑制移植肾早期炎性因子mRNA的表达水平。
　　3.ARA290通过抑制NF-κB的DNA结合活性，实现其对移植肾早期的保护作用。

目录

声明

摘要

中英文缩写词对照表

前言

参考文献

第一部分 促红素衍生肽ARA290对内皮细胞低温缺氧复氧损伤中保护作用及机制研究

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 促红素衍生肽ARA290减轻大鼠移植肾早期损伤保护及机制研究

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述 促红素衍生肽与肾脏缺血再灌注损伤

攻读学位期间取得的研究成果

致谢