新型促红素衍生肽对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

摘要

目的：在小鼠肾脏缺血再灌注(Ischemia Reperfusion，I/R)损伤模型中探究新型促红细胞生成素B螺旋表面肽(Helix B surface peptide，HBSP)对肾功能及组织结构的保护作用，并明确组织保护性β共同受体(Beta Common Receptor，βcR)亚单位在肾脏局部的表达分布及其在缺血再灌注损伤中的变化，进一步探讨HBSP对凋亡通路蛋白caspase-9及caspase-3活化的影响，并研究细胞内抗凋亡信号通路PI3K/Akt在其中的作用，阐明HBSP的肾脏保护机制，为其临床转化提供理论依据。
　　 方法：选择20-25g雄性BALB/c小鼠24只，随机分为I/R组6只(I/R)，HBSP组6只(HBSP)，HBSP+Wortamannin组6只(H+W，wortmannin为PI3K通路抑制剂)，假手术组6只(sham)。建立双侧肾蒂夹闭30min模型，假手术组仅游离双侧。肾蒂而不行结扎。根据参考文献，HBSP组于手术后1min、6h、12h给予腹腔注射HBSP，剂量8nmol/kg，H+W组于术前30min腹腔注射wortmannin，剂量1mg/kg，I/R组及sham组均腹腔给予等量生理盐水。各组于缺血再灌注后48h取心脏血测肾功能指标(血肌酐、尿素氮)，同时取肾脏标本制作石蜡切片行HE及TUNEL染色，进一步观察组织病理改变及调亡水平。应用免疫组化技术分别检测I/R组及sham组肾脏受体亚单位βcR和促红素受体亚单位(erythropoietin receptor，EPOR)的分布及表达情况，并应用免疫共沉淀技术进一步检测各组肾组织中功能性βcR/EPOR异二聚体的表达水平。应用western blot检测各实验组及wortmannin组小鼠肾组织中PI3K p85、总Akt以及磷酸化Akt的表达水平。应用免疫组化检测各组肾组织切片中活化型caspase-3阳性细胞数量，并进一步应用western blot检测各组肾组织中49kD全长型caspase-9、37/39kD活化型capsase-9及17kD活化型caspase-3的表达水平。
　　 结果：HBSP组术后血肌酐和尿素氮水平显著低于I/R组(23.83±1.32 vs。119.80±6.41μmol/L，P<0.01；10.62±0.79 vs.50.33±5.09mmol/L，P<0.01)。光镜下HE染色切片可见HBSP组肾脏损伤程度与I/R组相比明显减轻，小球结构基本清楚，小管上皮细胞轻度水肿，基底膜较完整，小管内少量管型，肾小管损伤病理评分明显降低(1.17±0.31 vs.4.50±0.43，p<0.01)。TUNEL染色可见HBSP组凋亡阳性细胞明显少于I/R组，半定量结果有统计学差异(3.83±1.40 vs。24.17±1.45，p<0.05)。组织保护受体的亚单位βcR和EPOR主要组成性表达于肾小管上皮细胞，并在缺血再灌注损伤后明显上调(94.83±4.19 vs。130.70±13.80，p<0.05；184.30±6.97 vs.246.5±15.43，p<0.01)，进一步探究发现βcR/EPOR异二聚受体在肾组织中组成性表达，且缺血再灌注损伤对其亦有显著的刺激作用(与EPOR共沉淀的βcR/GAPDH，0.47±0.12 vs.0.95±0.12，p<0.05)。实验组肾组织中PI3K p85表达水平无明显差异。HBSP组肾脏中总Akt表达水平以及磷酸化蛋白p-Akt-ser473和p-Akt-th308表达水平均较I/R组明显升高(/β-actin，0.44±0.042 vs.0.21±0.04，p<0.05；2.09±0.55 vs.0.13±0.01，p<0.05；0.77±0.12 vs.0.12±0.06，p<0.01)。wortmannin对PI3K/Akt通路蛋白表达，包括PI3K p85、Akt及其磷酸化蛋白具有普遍的抑制作用(/β-actin，0.07±0.04 vs。0.44±0.04，p<0.05；0.05±0.01 vs.2.09±0.55，p<0.05；0.01±0.00 vs.0.77±0.12，p<0.01)。HBSP组肾脏中caspase-3阳性细胞数量明显少于I/R组(1.33±0.42 vs。8.67±0.67，p<0.01)，而PI3K/Akt通路抑制剂wortmannin能明显逆转HBSP的作用(15.67±1.98 vs.1.33±0.42，p<0.01)。各组肾组织中49kD全长型Caspase-9表达无统计学差异，而HBSP组39kD、37kD活化型片段及caspase-3的17kD活化型片段均较IR组显著降低(/β-actin，0.60±0.07 vs.1.55±0.32，p<0.05；0.05±0.01 vs.0.89±0.31，p<0.05；0.08±0.03 vs.0.26±0.04，p<0.05)，wortmannin亦明显逆转HBSP对上述caspase-9及caspase-3活化片段的抑制作用(/β-actin，2.95±0.58 vs.0.60±0.07，p<0.05；2.01±0.17 vs.0.05±0.01，p<0.01；1.85±0.62 vs.0.08±0.03，p<0.05)。
　　 结论：新型促红细胞生成素衍生肽HBSP能显著减轻肾脏缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞损伤程度和凋亡水平，具有良好的肾脏保护作用。组织保护性受体βcR/EPOR组成性表达于肾脏中，并在缺血再灌注损伤中上调表达，是HBSP肾脏保护作用的基础。HBSP通过上调细胞内Akt蛋白表达及磷酸化水平，活化PI3K/Akt信号通路，抑制凋亡蛋白caspase-9及caspase-3的活化，实现其抗凋亡作用。