六味地黄丸对IL-1β、TNF-α干预下人牙周膜成纤维细胞增殖及OPG/RANKL表达的影响

摘要

研究背景：
　　牙周病(periodontaldiseases)指发生在牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）的各种疾病[1]。它是口腔两大类主要疾病之一，在世界范围内均有较高的患病率。而在我国，其患病率更是居于龋病之上。另外我国正进入老龄化社会，牙周病成为更加突出的保健问题。
　　牙槽骨是牙周支持组织的重要组成部分，与牙龈、牙周膜及牙骨质共同维持牙齿的稳固。牙周炎的重要病理变化之一是牙槽骨吸收，它使得牙齿的支持组织丧失，牙齿逐渐松动，最终脱落或拔除，严重影响患者的咀嚼功能及美观。所以，针对骨吸收控制的实验及临床研究正在不断深入。
　　骨吸收主要是破骨细胞(osteoclast，OC)的作用。近年来的研究显示破骨细胞的功能受一系列因素的局部调节，如IL-1、IL-6、TNF-α、PGE2和淋巴毒素等。牙周病的始动因子牙菌斑，细菌释放的脂多糖和其它产物能刺激组织内的免疫细胞及成骨细胞释放炎症介质，继而可以激活巨噬细胞和成纤维细胞分泌细胞因子，诱导大量的破骨细胞形成最终导致牙槽骨吸收。
　　近年的研究发现OPG/RANK/RANKL系统是调节破骨细胞生成和活化的关键因子。牙周病病变部位具有促进骨吸收活性的各种细胞因子，虽对OC形成和活化有协同作用，但局部RANKL表达的改变才是直接促进OC形成和活化的关键[2]。实验研究证实，在牙槽骨局部骨吸收过程中RANKL表达增加，活动期牙周炎患者RANKL/OPG比率上升[3]。牙周膜成纤维细胞（periodontalligamentfibroblasts，PDLFs）是牙周膜中最多，功能上也是最重要的细胞，是人牙周膜组织中的主要间质细胞，在牙周组织的生理和病理中起重要作用，其中具有成骨细胞表型的亚类可表达OPG和RANKLmRNA，双向调节破骨细胞的分化[4]。
　　在抑制骨吸收的药物研究中，中药以其副作用小而受到关注。滋阴补肾代表方六味地黄丸为历代医家推崇，有促进骨骼生长之功效，出自宋代钱乙《小儿药证直诀》，原为治疗肾虚生骨迟缓的小儿“囟开不合”而设。现代研究也证实其具有调节钙磷代谢，促进骨折愈合的功能。近年来用以防治牙槽骨吸收的固齿膏及固齿丸等药物均为在六味地黄丸的基础上加减而成。有研究表明六味地黄汤可以双向调节机体免疫功能，能够抑制烫伤后大鼠腹腔巨噬细胞TNF-α分泌和降低血清IL-6水平[5]。炎症过程中所产生的IL-1和PGE2等均能影响RANKL和OPG的表达[6]。六味地黄丸是否通过其抗炎作用下调RANKL的表达而抑制骨吸收并促进骨形成，到目前为止未见此类报道。所以本实验从OPG/RANK/RANKL系统入手研究六味地黄丸对牙槽骨吸收作用的分子机理，有利于深入探讨中医学“补肾固齿”理论的实质，同时为中药治疗牙周炎牙槽骨吸收提供一定的实验依据，对牙周病的防治产生重要意义。
　　目的：
　　1、研究六味地黄丸对人牙周膜成纤维细胞增殖及OPG/RANKL表达的影响。
　　2、研究六味地黄丸对IL-1β、TNF-α干预下人牙周膜成纤维细胞增殖及OPG/RANKL表达的影响。
　　3、探讨中医学“补肾固齿”理论实质。
　　方法：
　　1、采用酶消组织块法体外培养人牙周膜成纤维细胞，并进行传代培养、免疫组化鉴定细胞来源并绘制细胞生长曲线。
　　2、利用MTT法检测六味地黄丸对IL-1β、TNF-α干预下人牙周膜成纤维细胞增殖的影响。
　　3、采用免疫组织化学法检测六味地黄丸对IL-1β、TNF-α干预下人牙周膜成纤维细胞OPG/RANKL表达的影响。
　　结果：
　　1、成功获取原代及传代培养的人牙周膜成纤维细胞，免疫组化方法鉴定发现细胞角蛋白染色呈现阴性，波形丝蛋白染色呈现阳性，证实细胞来源于间充质，并绘制出了细胞生长曲线图。
　　2、MTT法结果显示:在2-4天当六味地黄丸水提液浓度由0.001mg/ml增大到0.1mg/ml时，药物对hPDLFs增殖的促进作用逐渐增加，且随时间增加增幅加大，差异有统计学意义(P＜0.05);浓度在1和10mg/ml时药物对细胞表现抑制作用，差异有统计学意义(P＜0.05)。六味地黄丸水提液+IL-1β组与IL-1β组比较，六味地黄丸水提液+IL-1β组值在各时间点OD值均高于IL-1β组，差异有统计学意义(P＜0.05);六味地黄丸水提液+TNF-α组与TNF-α组比较，六味地黄丸水提液+TNF-α组值在各时间点OD值均高于TNF-α组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、免疫组化结果显示:六味地黄丸水提液组与正常细胞组相比，药物干预组OPG表达测量值高于对照组，第4天高于第2天;而RANKL表达测量值低于对照组，第4天低于第2天，差异有统计学意义(P＜0.05);六味地黄丸水提液+IL-1β组与IL-1β组、六味地黄丸水提液+TNF-α组与TNF-α组比较，添加六味地黄丸组OPG表达测量值高于不添加组，第4天高于第2天;RANKL表达测量值低于不添加组，第4天低于第2天，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：
　　1、六味地黄丸水提液在0.001-0.1mg/ml浓度范围内对hPDLFs增殖有促进作用。
　　2、六味地黄丸水提液不仅能改善IL-1β、TNF-α对hPDLFs增殖的抑制作用，而且能上调IL-1β、TNF-α干预下hPDLFsOPG的表达同时降低细胞RANKL的表达。
　　3、上述两结论可以说明六味地黄丸可通过抑制IL-1β、TNF-α对人牙周膜细胞的作用而减轻炎症反应，并且通过下调细胞RANKL表达、上调OPG表达而抑制牙槽骨吸收。进而可推断中药可能通过抑制炎症因子对OPG/RANK/RANKL系统的作用而达到“固齿”的效果。这就为中医学“补肾固齿”理论提供重要实验依据，也为中药治疗牙周炎牙槽骨吸收提供基础理论依据。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

引言

第一部分 人牙周膜成纤维细胞的原代培养及鉴定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 六味地黄丸对IL-1β、INF-α干预下人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分 六味地黄丸对IL-1β、INF-α干预下人牙周膜细胞OPG／RANKL表达的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

个人简历

致谢