通路抑制剂LY294002、PD98059对SDF-1介导的卵巢癌细胞增殖和侵袭能力的影响

摘要

背景与目的
　　基质衍生因子-1（stromalcell-derivedfactorl，SDF-1）是由骨髓基质细胞及其他相关的间皮细胞和上皮细胞分泌的一种趋化蛋白，系统命名为CXCL12。趋化因子受体4(chemokinereceptor4，CXCR4)是SDF-1的主要受体。SDF-1与CXCR4特异性结合后形成的SDF-1/CXCR4生物轴广泛参与体内多种病理生理过程，研究证实SDF-1/CXCR4与肿瘤的增殖、浸润和转移密切相关。SDF-1与CXCR4的结构和相互作用机制是发挥其病理、生理功能的基础。尽管有报道称SDF-1、CXCR4在卵巢癌组织及细胞中呈高表达，SDF-1可促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭、迁移能力，但关于SDF-1/CXCR4对卵巢癌增殖和侵袭能力影响的作用机制尚不清楚。信号通路的激活是癌发生的早期事件，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号途径是细胞内重要的信号传导通路;分裂原活化抑制剂/蛋白激酶(MEK/ERK)信号途径是重要的细胞外信号传导通路。本实验主要研究SDF-1对卵巢癌细胞的增殖、侵袭能力的促进作用是否能被MEK抑制剂PD98059、Akt抑制剂LY294002所阻断，从而探讨SDF-1/CXCR4生物轴与信号通路MEK/ERK及PI3K/AKT信号通路的关系。
　　方法
　　1.细胞培养卵巢癌细胞系SKOV3，应用含12％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中孵育。
　　2.采用细胞免疫化学检测SDF-1作用不同时间以及不同作用浓度，卵巢癌细胞表达磷酸化AKT(P-AKT)和ERK(P-ERK)水平的变化;
　　3.采用四甲基亚唑蓝(MTT)法检测卵巢癌SKOV3细胞在100ng/mlSDF-1、10μg/mlCXCR4中和抗体、1μg/mlCXCR4抑制剂AMD3100、50μmol/LLY294002、50μmol/LPD98059作用下细胞增殖能力的变化。
　　4.采用Transwell细胞侵袭实验法检测卵巢癌SKOV3细胞在100ng/mlSDF-1、10μg/mlCXCR4中和抗体、1μg/mlCXCR4抑制剂AMD3100、50μmol/LLY294002、50μmol/LPD98059作用下细胞侵袭能力的变化。
　　5.采用SPSS16.0统计软件处理数据，定性资料采用等级资料秩和检验;定量资料以(x)±s表示，方差齐性检验，多组间的比较采用方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05,以P＜0.05为差异具有统计学意义。
　　结果
　　1.磷酸化的ERK蛋白主要表达于SKOV3细胞的胞质和胞核中，以胞核表达为主，磷酸化的Akt主要表达于卵巢癌细胞的胞质中，镜下可见棕黄色颗粒。根据阳性细胞数及细胞染色程度表示蛋白表达水平，随着100ng/mlSDF-1作用时间的延长，棕黄色颗粒由浅至深，差异具有统计学意义(P-ERK:x2=24.011,P=0.000;P-AKT:x2=16.408,P=0.003);30分钟组与60分钟组相互比较，细胞内棕黄色颗粒的染色程度基本一致，无明显差异(P-AKT:x2=4.835,P=0.089;P-ERK:x2=1.725,P=0.422)。可见100ng/mlSDF-1的最佳作用时间为30分钟;当作用时间为30分钟时，随SDF-1浓度的增加，PERK、P-Akt蛋白的染色程度也随之加重，差异具有统计学意义(P-ERK:x2=8.467，P-0.015;P-AKT:x2=8.345，P=0.015。
　　2.与无血清对照相比，SDF-1组的吸光度值(OD492)明显较高(d=-0.12378,P=0.007);但同时加入10μg/mlCXCR4中和抗体(d=0.12956,P=0.005)、1μg/mlCXCR4抑制剂AMD3100后(d=0.13900,P=0.003)，与SDF-1组相比，吸光度值(OD492)则无明显升高;此外，在SDF-1中同时加入50μmol/LPD98059(d=0.11594,P=0.014)、50μmol/LLY294002(d=0.10978,P=0.025)后，与SDF-1组相比，吸光度值(OD492)亦无明显升高。
　　3.与无血清对照相比，SDF-1组的迁移细胞数（平均70.2±9.22316个）明显多于无血清对照组（平均23.1±1.64007个），差异具有统计学意义(d=-47.1,P=0.000);但同时加入10μg/mlCXCR4中和抗体（平均27.7±4.73873个）、1μg/mlCXCR4抑制剂AMD3100（平均30.3±6.25478个）后，细胞穿透数目无明显增多，与SDF-1组相比差异具有统计学意义;此外，同时加入50μmol/LPD98059（平均20.7±4.34741个）、50μmol/LLY294002（平均24.3±3.59166个）后，细胞穿透数目亦无明显增多，与SDF-1组相比差异具有统计学意义。
　　结论
　　SDF-1可促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力，但这种作用可被MEK抑制剂PD98059、Akt抑制剂LY294002所阻断和拮抗，因此SDF-1/CXCR4可能通过MEK/ERK信号转导通路、PI3K/Akt信号通路发挥作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词

引言

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

3．结果判断

4．统计分析

结果

1．SDF-1作用不同时间、不同浓度，卵巢癌细胞中P-AKT、P-ERK的表达情况

2． MTT细胞增殖实验

3．Transwell细胞侵袭实验

讨论

1．不同作用时间、作用浓度下SDF-1对卵巢癌细胞通道蛋白表达情况的影响

2．通道抑制剂对SDF-1作用下卵巢癌细胞增殖能力的影响

3． 通道抑制剂对SDF-1作用下卵巢癌细胞侵袭能力的影响

结论

参考文献

综述 SDF-1／CXCR4与恶性肿瘤研究进展

个人简历

致谢