分泌型IgA在IgA肾病发病中的作用及机制研究

摘要

背景：
　　IgA肾病（IgA nephropathy，IgAN）是我国乃至全球最常见的原发性肾小球肾炎，其特征是免疫荧光下见到以IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜区和/或肾小球毛细血管襻沉积。据2014年最新资料显示，全球 IgAN的发病率为2.5人/10万人/每年，约20％-50%的患者20年可进展为终末期肾脏病。但是， IgAN的发病机制仍然不十分清楚。因IgAN患者常在上呼吸道或肠道等粘膜感染后发生肉眼血尿和/或蛋白尿，提示粘膜免疫与IgAN的发病机制密切相关。分泌型IgA（secretory IgA，SIgA）是参与粘膜免疫最重要的抗体，近年来的研究发现，SIgA在 IgAN的发病中可能也起着一定的致病作用。IgAN的病理类型及临床表现具有多样性，是否因为有 SIgA的参与？SIgA可以沉积在 IgAN患者的系膜区，那么它对系膜细胞具有损伤作用吗？SIgA发挥这些致病损伤作用的机制是什么呢？迄今为止，还未见相关报道。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中一类具有内源性调控功能的非编码RNA，它通过与靶基因信使 RNA（messenger RNA，mRNA）的3’端非编码区（untranslated region，UTR）结合，发挥抑制翻译的作用。研究提示，miRNAs在肾脏病中也起了重要的作用。那么SIgA是否通过作用miRNAs来发挥在IgAN中的致病性呢？
　　第一部分、IgA肾病患者分泌型IgA在肾组织的沉积以及同临床病理之间的关系
　　目的：
　　检测IgAN患者肾组织中SIgA沉积的比例；分析SIgA与临床及肾脏病理之间的关系。
　　方法：
　　选取263名原发性IgAN患者，应用激光共聚焦显微镜观察肾组织SIgA的沉积，并比较有SIgA沉积和无沉积患者的临床及肾脏病理各项指标的不同。
　　结果：
　　1.263名IgAN患者中87名可见到系膜区SIgA的沉积，约占29.28%；
　　2.同系膜区无SIgA沉积的病人相比较，有SIgA沉积的病人具有明显的感染史（P=0.016）及血尿（P=0.024）发生率，临床指标上具有明显低水平的血清胱抑素C（P=0.027）和β2微球蛋白（P=0.018），病理特征上具有更微的肾脏小管间质损伤（P=0.030）和更低的T评分（牛津分型，P=0.026）。
　　结论：
　　粘膜免疫同IgAN密切相关，SIgA参与了IgAN的发病，它在肾组织的沉积与某些的临床肾脏病理指标相联系。
　　第二部分、分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究
　　目的：
　　检测IgAN患者肾组织中SIgA激活的补体通路来研究SIgA的肾损伤作用，以及比较肾组织经不同补体途径激活的IgAN患者之间的临床病理特征。
　　方法：
　　选取87名原发性IgAN患者，应用激光共聚焦显微镜观察肾组织SIgA以及各补体通路相关蛋白的沉积，探讨SIgA与各补体通路激活的关系，并比较不同补体激活通路的患者临床及肾病理特点之间的差别。
　　结果：
　　1.87名IgAN患者中有22名可见到系膜区SIgA沉积，其中经旁路途径激活的占77.27%，在65名无SIgA沉积的患者中经凝集素途径激活的占72.30%，两组比较无明显差别（P=0.648）；
　　2.同肾组织经凝集素途径激活的患者相比较，经旁路途径激活的64人（73.6%）在临床指标方面具有更低的肾小球滤过率（P=0.043），在肾病理方面肾小球硬化比例（P=0.035）、小管间质损伤程度（P=0.030）、C3的免疫荧光强度（P=0.012）以及牛津评分的S（P=0.006）和T评分（P=0.039）均损伤更严重。
　　结论：
　　在IgAN中SIgA具有致病性，可能通过激活旁路途径和凝集素途径造成肾损伤；经旁路途径激活的IgAN患者部分临床和肾病理特征比经凝集素途径激活的患者严重。
　　第三部分、分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究
　　目的：
　　研究SIgA对人系膜细胞的生物学效应，探讨SIgA在IgAN中的致病作用。
　　方法：
　　运用亲和层析柱提纯IgAN患者及正常人唾液中的SIgA，应用亲和层析柱和分子筛提纯IgAN患者及正常人血中的多聚IgA（polymeric IgA，pIgA）；将提纯的SIgA及pIgA分别刺激人系膜细胞，检测细胞的增殖及各种促炎促纤维化因子（IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纤维粘连蛋白）在细胞中mRNA及蛋白水平的表达情况，并相互比较。
　　结果：
　　1.SIgA和pIgA均能使人系膜细胞明显增殖（P<0.05），表达IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纤维粘连蛋白明显增多（mRNA和蛋白水平，P<0.05），并且患者来源的SIgA和pIgA对细胞的上述生物学效应均明显强于正常人来源的刺激作用（P<0.05）；
　　2.经IgAN患者唾液纯化的SIgA对系膜细胞的增殖作用及刺激其分泌IL-6、IL-8和纤维粘连蛋白的作用要明显弱于经IgAN患者血清纯化的pIgA作用（P<0.05）。
　　结论：
　　在IgAN中SIgA有致病作用，SIgA具有刺激系膜细胞增殖和释放促炎促纤维化细胞因子的生物学效应，并且SIgA与pIgA对系膜细胞的生物学效应是不完全相同的。
　　第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证
　　目的：
　　筛选与SIgA致病性有关的miRNAs，研究SIgA在IgAN中产生致病性的分子机制。
　　方法：
　　运用Agilent human miRNAs芯片，检测经IgAN患者及正常人SIgA刺激的系膜细胞中的miRNAs，并分析筛选其中差异性表达的miRNAs，应用实时荧光定量PCR分别进行验证。
　　结果：
　　1.通过miRNAs芯片筛选了17个经IgAN患者及正常人的SIgA刺激后细胞内差异表达的miRNAs，其中上调5个、下调12个；
　　2.经实时荧光定量 PCR验证芯片筛选结果中的miRNAs，趋势均一致，其中16个表达差异显著（P<0.05），1个差异性不显著（P>0.05）。
　　结论：
　　SIgA在IgAN发挥致病性的机制中，miRNAs参与其中。
　　第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制
　　目的：
　　预测和验证了miR-16-2-3p和miR-100-3p的靶基因，进一步探讨SIgA在IgAN中产生致病性的分子机制。
　　方法：
　　通过生物信息学方法对miRNAs芯片筛选结果中的miR-16-2-3p和miR-100-3p进行靶基因预测，建立融合靶基因3‘UTR的荧光素酶报告基因载体，通过双报告荧光素酶基因检测方法确定miR-16-2-3p和miR-100-3p的靶基因；应用实时荧光定量PCR和Western blot研究miR-16-2-3p和miR-100-3p对其靶基因的内源性调控作用。
　　结果：
　　1.成功构建了能够过表达miR-16-2-3p和miR-100-3p的报告基因载体；
　　2.荧光素酶双报告基因检测显示，miR-16-2-3p和miR-100-3p的复制物可以分别与报告基因载体的IL-6和IL-83’UTR野生序列结合，使载体的荧光素酶活性降低，而IL-6和IL-83’UTR突变序列不能产生这样的作用（P<0.05）；
　　3.MiR-16-2-3p过表达可以抑制SIgA刺激系膜细胞中分泌IL-6蛋白过多的情况，但不影响IL-6 mRNA的水平（P>0.05），同样miR-100-3p过表达可以抑制其分泌IL-8蛋白过多的情况，但不能影响IL-8 mRNA的水平（P>0.05）。
　　结论：
　　MiR-16-2-3p的靶基因是IL-6，miR-100-3p的靶基因是IL-8；SIgA通过作用miR-16-2-3p和miR-100-3p来分别调控系膜细胞产生炎症因子IL-6和IL-8，是SIgA在IgAN中产生致病性的分子机制之一。
　　全文结论
　　SIgA参与了IgAN的发病，它在肾组织的沉积同一定的临床肾脏病理指标相联系；
　　SIgA在IgAN中具有致病作用，表现在有可能激活旁路途径和凝集素途径造成肾损伤，刺激系膜细胞增殖并释放促炎促纤维化细胞因子；
　　SIgA通过作用miR-16-2-3p和miR-100-3p来分别调控系膜细胞产生炎症因子IL-6和IL-8，可能是SIgA在IgAN中发挥致病作用的机制之一。

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主要符号和缩略语说明

引言

本课题的创新点：

第一部分 分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系

1. 实验材料

2 实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

5. 小结

第二部分 分泌型IgA 在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究

1.实验材料

2 方法

3 结果

4.讨论

5.小结

第三部分 分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究

1 实验材料

2 方法

3. 实验结果

4 讨论

5 小结

第四部分 与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证

1. 实验材料

2方法

3结果

4 讨论

5 小结

第五部分 miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

全文结论

参考文献

综述:MicroRNAs与IgA肾病关系的研究进展

个人简历

攻读博士期间发表文章及研究成果

致谢