PDGF-D和JAK/STAT信号通路在IgA肾病发病中的作用以及雷帕霉素对IgA肾病的影响

摘要

目的：IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)是目前世界上最常见的慢性进行性的原发性肾小球疾病。其主要病理特征是IgA免疫复合物在系膜区沉积，导致系膜细胞的增殖和细胞外基质的沉积，引起一系列临床及病理生理改变，是导致终末期肾病(ESRD)的主要原因之一。随着肾脏活组织穿刺技术的逐渐推广，儿童IgA肾病的诊断率也在逐年提高，而有关IgA肾病的发病机制则是目前众学者研究的热点。本研究以IgA肾病患儿、IgA动物模型以及PDGF-D培养的系膜细胞为对象，采用多种实验技术，从整体、细胞和分子等不同水平检测IgA肾病肾小球细胞JAK/STAT信号途径的变化以及PDGF-D在IgA肾病发病过程中的动态变化，同时还观察了雷帕霉素对IgA肾病的作用及影响。 方法： 1.IgA肾病儿童PDGF-D和JAK/STAT信号蛋白的检测 标本均来自2004年1月～2007年10月在我科住院并行肾活检确诊的52例IgA肾病患儿，其中男29例，女23例；年龄5～16岁，平均(10.7±3.1)岁。实验分四组：对照组16例；轻度增生组17例(Hass Ⅰ、Ⅱ型)；局灶增生组18例(HassⅢ型)；增生硬化组17例(HassⅣ、Ⅴ型)。正常对照组儿童32例，其中16例来自我院儿保门诊健康查体的儿童，无各种原发及继发性肾脏疾患，16例肾组织标本均取自肾脏疾病术后病理检查正常的患儿。ELISA法检测IgA肾病患儿血、尿PDGF-D和PDGF-B水平，免疫组织化学染色法检测PDGF-D、PDGF-B、PDGFR-β、STAT3、p-STAT3、P-JAK2、SOCS1和SOCS3蛋白表达。 2.大鼠IgA肾病模型的制备和PDGF-D及JAK/STAT信号蛋白的检测 Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组和IgA肾病组，IgA肾病模型制备：隔日牛血清白蛋白400mg·kg-1·d-1灌胃，持续6周，皮下注射蓖麻油0.5ml+四氯化碳0.1ml，每周一次，持续9周，脂多糖分别于第6、8周以0.05mg尾静脉注射，观察至10周末。将肾皮质组织切成3μm的冰冻切片，采用兔抗大鼠IgA和FITC标记羊抗兔IgG间接免疫荧光染色，荧光显微镜下观察肾小球系膜区IgA沉积阳性，PASM和Masson染色显示系膜细胞增生和系膜基质的沉积表明造模成功，成功率为90％。分别于成模后1、2、4、8周每组取7只大鼠，切取肾脏。取部分肾组织置于4％多聚甲醛固定用于光镜观察及免疫组化检测：部分肾皮质组织用于提取肾组织总RNA和肾组织总蛋白。免疫组织化学染色法和Western blot检测肾组织PDGF-D、PDGF-B、PDGFR-β、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3蛋白表达；半定量RT-PCR检测肾组织PDGF-D mRNA、PDGF-BmRNA、STAT3 mRNA、SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA表达。 3.PDGF-DD对体外培养大鼠肾小球系膜细胞JAK/STAT信号途径的影响 取人系膜细胞株，用无血清RPMI1640培养液洗一次，换无血清RPMI1640培养液孵育24h，使细胞同步化。用MTT法观察不同时间(6、12、24、48h)和不同浓度(0、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml)PDGF-DD对细胞增殖状态的影响。同时观察JAK2激酶特异抑制剂AG490对PDGF-DD条件下细胞增殖的影响。将细胞分成3组：对照组；PDGF-DD刺激组(20ng/ml)和PDGF-DD+AG490组(20ng/ml PDGF-DD+10μmol/LAG490)。分别在24孔板和25cm2塑料培养瓶内培养。于刺激的0、30min、60min、120min和240min收集细胞，提取细胞总蛋白、RNA。采用免疫细胞化学和Western blot检测p-JAK2、STAT3、P-STAT3、SOCS1和SOCS3等的表达；半定量RT-PCR检测细胞SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA的表达。 4.雷帕霉素对IgA肾病大鼠和体外培养系膜细胞和JAK/STAT信号途径的影响 IgA肾病大鼠随机分成5组：正常对照组、IgA肾病组和雷帕霉素不同剂量组(0.5mg·kg-1·d-1、1mg·kg-1·d-1、2 mg·kg-1·d-1)。于治疗后4周收集血、尿和肾组织。部分肾组织经4％多聚甲醛固定、石蜡包埋，用于形态学观察和免疫组化。应用免疫组化、Western blot以及RT-PCR等方法，观察雷帕霉素对IgA肾病大鼠肾组织p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3蛋白及STAT3 mRNA、SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA表达的影响。 取人系膜细胞株种植于96孔板，采用MTT法分别检测对照组、PDGF-DD刺激组以及干预药物雷帕霉素在不同时间、不同药物浓度对系膜细胞增殖状态的影响。采用25cm2塑料培养瓶培养细胞，将细胞分成3组：对照组；PDGF-DD刺激组(20ng/ml)；PDGF-DD+RPM组(20ng/mlPDGF-DD+20μg/ml RPM)。于刺激的24h收集细胞，提取细胞总蛋白和RNA。采用Western blot检测p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3的表达；半定量RT-PCR检测细胞SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA的表达。 结果： 1.JAK/STAT信号蛋白在IgA肾病人体、大鼠肾组织及系膜细胞中的表达 人体实验结果：免疫组化显示正常对照组STAT3在肾小球系膜区和肾小管呈灶状微量表达，其中个别。肾小管可见p-STAT3表达；STAT3和p-STAT3在IgA肾病各组肾小球系膜区和肾小管的表达增加，p-STAT3的活化程度随病变程度的加重而逐渐增加，各病变组与对照组相比均有显著差异。SOCS1和SOCS3在正常对照组肾小球无明显表达，在IgA肾病组呈阳性表达。与正常对照组相比，IgA肾病各组患儿随着肾小球病变程度的加重，SOCS1和SOCS3的阳性率呈逐渐增高趋势。 动物实验结果：①光镜下观察，IgA肾病组大鼠在成模后4周内肾小球均未见明显增大，到第8周时肾小球体积有轻度增大，但无统计学意义。②免疫组化显示STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3在对照组和IgA肾病组大鼠肾组织中均有阳性表达。STAT3在细胞浆和细胞核均有表达，p-STAT3主要在细胞核表达，SOCS1和SOCS3主要在细胞浆表达。主要分布在肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和间质细胞。与同期对照组相比，IgA肾病大鼠肾组织中STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3均从第1周表达开始增高，第2周时达到高峰，第4周至第8周时表达有所下降，但明显高于相应对照组。③Western blot显示，p-JAK2自IgA肾病第1周起表达开始增高，随时间延长而逐渐增高；肾组织STAT3、p-STAT3和SOCS1蛋白水平自IgA肾病成模后第1周起表达开始增加，在第2周时表达水平最高，第4周至第8周时表达水平开始有所下降，但仍明显高于对照组；SOCS3蛋白水平自IgA肾病成模后第2周起表达开始增加，在第4周时表达水平最高，第8周时表达水平开始有所下降，但仍明显高于对照组。④半定量RT-PCR结果显示，STAT3 mRNA、SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA在对照组肾小球有少量基础表达，不同时间表达无差异。IgA肾病组自成模后第1周起STAT3 mRNA和SOCS1 mRNA表达开始增加，随着时间延长，其表达也逐渐增加，于第2周表达最高，第4周到第8周出现回落，但仍高于对照组。SOCS3 mRNA从第2周起表达开始增加，于第4周达到高峰，第8周开始出现回落。 2.PDGF-D、PDGF-B和PDGFR-β在IgA肾病人体及大鼠肾组织中的表达 3.雷帕霉素对IgA肾病大鼠和体外培养系膜细胞JAK/STAT信号途径的影响 结论：①IgA肾病患者和IgA肾病模型动物。肾组织细胞信号蛋白p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3和PDGF-D表达均明显升高，STAT3、SOCS1、SOCS3和PDGF-D mRNA亦明显上调，表明PDGF-D和JAK/STAT信号转导途径可能参与了IgA肾病的发病过程。②PDGF-DD能够活化体外培养的人肾小球系膜细胞JAK/STAT信号途径，使信号蛋白JAK2和STAT3的磷酸化增强，SOCS1和SOCS3蛋白及mRNA的表达增加。JAK2特异性抑制剂AG490能够降低PDGF-DD刺激引起的系膜细胞p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1和SOCS3蛋白及mRNA的表达，提示PDGF-D可能通过激活JAK/STAT信号途径参与了IgA肾病的发病过程。③雷帕霉素治疗能够明显抑制IgA肾病大鼠肾组织JAK/STAT信号蛋白的表达，使大鼠的血、尿生化指标明显缓解：雷帕霉素能够抑制PDGF-DD刺激引起的系膜细胞JAK/STAT信号途径的活化，提示其肾脏保护作用可能部分是通过影响JAK/STAT信号途径活化实现的。雷帕霉素有望成为临床治疗IgA肾病患者的有效药物。④PDGF-D中和抗体及PDGF-D受体拮抗剂可能成为临床治疗IgA肾病的新趋势。JAK/STAT信号转导抑制剂可能成为临床治疗IgA肾病患者的新途径。

目录

论文说明：英文缩写

声明

摘要

引言

第一部分JAK/STAT信号通路在IgA肾病肾组织中的表达

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第二部分PDGF-D及其β受体在IgA肾病中的作用机制研究

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第三部分PDGF-DD对肾小球系膜细胞JAK/STAT信号途径的影响

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第四部分雷帕霉素对IgA肾病大鼠肾组织和系膜细胞JAK/STAT信号途径的影响

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述PDGFs与肾脏疾病的研究进展

致谢

个人简历