Pim-3表达下调对肺腺癌A549细胞生物学行为影响及其分子机制

摘要

肺癌居全球肿瘤发病死亡原因的首位。尽管目前的诊断和治疗方案有很大的改善，但是处于不同临床阶段的肺癌病人的5年生存率仍为15％左右，这可能是由于其高转移潜能所致。目前，肺癌具有2种主要类型，即小细胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancers， NSCLC），当前肺癌的大多数病例是NSCLC，其占所有肺癌病例的85%左右。长期抽烟人群是肺癌发生的主要原因（80-90%），而非吸烟者大约占10-15%，这可能是由于遗传因素和环境因素共同作用的结果。在所有的治疗方案中，化疗对NSCLC仅有微小的效果，但受剂量相关的毒性限制。兴起的分子靶向治疗对改善肺癌病人的生存率方面发挥关键的作用，同时新的分子靶点也被鉴定，这为肺癌病人的治疗带来新的希望。最为重要的是，肺腺癌容易在不同的器官中形成远端的大的转移灶，这为肺腺癌患者的治疗带来新的挑战。因此开发新的有效的治疗方案和寻找早期肺腺癌的诊断标记仍是全球科研工作者共同关注的焦点。
　　Pim-3，作为一个新的癌基因，最初是在大鼠嗜铬细胞瘤细胞系 PC12细胞中通过膜的去极化或毛喉素诱导而鉴定出来的一个新基因，被命名为去极化诱导的激酶 KID-1。然而，由于 KID-1与前病毒整合位点莫罗尼鼠白血病病毒（Provirus integrating site Moloney murine leukemia virus，Pim）家族蛋白具有高度的序列相似性，因而重新命名为Pim-3。Pim-3主要定位于人类染色体22q13，其开放阅读框编码326个氨基酸，分子量为35861。人类Pim-3蛋白分别和Pim-1和Pim-2的氨基酸相似度为57.1%和44.0%，和其它物种Pim激酶的相似度分别为大鼠95.0%，小鼠95.0%，鹌鹑Pim73.9%和非洲爪蟾Pim-168.7%。在不同的人类组织中均发现有Pim-3 mRNA的表达，包括心脏、脑、肺、肾脏、脾脏、胎盘、骨骼肌和外周血白细胞。然而，在结肠、胸腺、肝脏和小肠中未见Pim-3 mRNA的表达。最近越来越多的研究表明，Pim-3与肿瘤的发生发展密切相关，其可能成为肿瘤治疗的潜在分子靶点。许多人类 Ewing家族的肿瘤细胞系中均有Pim-3 mRNA的表达。此外，在鼻咽癌细胞系中也发现Pim-3 mRNA的过表达。此外，研究表明，Pim-3在正常成人内胚层来源的器官中几乎不表达，如肝脏、胰腺、结肠和胃，然而，当这些器官发生病变或恶性损伤时，Pim-3的表达增强。Pim-3在这些肿瘤中几乎均定位于细胞质中。在肝脏中，Pim-3蛋白在再生结节和腺瘤样增生以及癌旁组织中有表达，而且检测表达的频率显著高于肝癌细胞。在结肠和胃癌中也具有相似的研究，如Pim-3蛋白的表达在腺瘤组织中比腺癌组织具有更高的发生率。这些研究表明，异常的Pim-3的表达可能发生在肿瘤发生的早期阶段，进而可能成为肿瘤发生早期的检测的分子标记。
　　此外，Pim-3在肿瘤中发挥生物学机制的作用形式多种多样。来自胰腺癌和结肠癌的研究表明，增加Pim-3的表达能增加Ser112位的Bad的磷酸化的总量，而Pim-3 shRNA作用后降低Ser112位的Bad的磷酸化的总量，因而，Pim-3可能抑制这些肿瘤细胞凋亡并最终导致肿瘤发生。研究表明，Pim-3 shRNA能显著诱导肝癌细胞的凋亡，并降低磷酸化的STAT3（Tyr705）（Signal transducers and activators of transcription3），Bcl-XL和pBad（Ser112）的表达水平，表明Pim-3表达下调通过降低 STAT3的磷酸化水平抑制肝癌细胞的增殖。此外，Pim-3与肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）具有十分重要的关系，TNF-α能增强Pim-3 mRNA的稳定性，而下调Pim-3的表达阻止TNF-α诱导的内皮细胞的形成，这些结果表明Pim-3在TNF-α诱导的血管生成中发挥重要的作用。这些机制的研究充分显示Pim-3在肿瘤发生发展中的重要性，因而可能成为肿瘤治疗的新的分子靶点。
　　然而，迄今为止，关于Pim-3在肺腺癌发生、发展及进展中的分子机制尚不清楚，因此，在本研究中，我们利用免疫组织化学方法检测肺腺癌组织和正常组织中 Pim-3蛋白的表达，分析其表达与肺腺癌病人临床病理学参数之间的关系，并采用Western blotting进一步验证肺腺癌组织和正常组织中Pim-3蛋白的表达，初步阐明其在肺腺癌发生发展中的作用。进一步我们通过 siRNA介导肺腺癌A549细胞中Pim-3表达下调，分析其对其表达下调对肺腺癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响，并检测STAT3信号途径的活化状态，分析该信号途径中下游靶基因表达的变化，初步揭示Pim-3在肺癌发生发展中的可能的分子机制，该研究为进一步以 Pim-3为靶点的肺腺癌病人的分子靶向治疗提供理论依据和实验证据。
　　方法
　　（1）采用免疫组织化学方法检测97例正常肺组织以及97例肺腺癌组织中Pim-3蛋白的表达，并分析Pim-3蛋白的表达与临床病理学参数之间的关系。
　　（2）采用Western blotting检测随机选取的4例肺腺癌组织和相对应的正常组织中Pim-3蛋白的表达。
　　（3）采用脂质体2000将对照siRNA（100 nM）和Pim-3 siRNA（100 nM）分别转染肺腺癌A549细胞，将细胞分为3组，即未处理的A549细胞组、对照siRNA组和Pim-3 siRNA组，采用Western blotting检测不同组别的肺腺癌A549细胞中Pim-3蛋白的表达。
　　（4）采用新型的 CCK-8试剂盒分析 siRNA转染前后不同组别的肺腺癌A549细胞增殖的改变。
　　（5）采用流式细胞术分析不同组别的肺腺癌 A549细胞的细胞周期以及细胞凋亡的变化。
　　（6）采用Western blotting技术检测3组不同的A549细胞中STAT3信号途径的活化状态及其下游靶基因p21、cyclin D1、Bcl-2和Bax的表达。
　　（7）统计学分析：所有的数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，统计学数据用均数±标准差（x?s）表示，免疫组织化学结果采用卡方分析，多个样本均数比较应用单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05具有显著性。
　　结果
　　（1）在97例肺腺癌组织中Pim-3蛋白的阳性表达例数为85例，其阳性表达率为87.63%，而97例正常组织中Pim-3蛋白的的阳性表达例数为8例，其阳性表达率为8.25%，二者之间 Pim-3蛋白的阳性表达率具有显著性差异（X2=122.456，P=0.000），这与Western blotting检测的随机4例肺腺癌组织和相对应的正常组织中的结果一致。
　　（2）Pim-3蛋白表达与肺腺癌病人的年龄和性别无关（P>0.05），但与肺腺癌病人的组织学分化、TNM分期、组织学分型以及淋巴结转移关系密切（P<0.05）。
　　（3）与未处理的A549细胞和对照siRNA组相比，Pim-3 siRNA组中Pim-3蛋白的表达显著降低（P<0.05），而未处理的A549细胞和对照siRNA组相比， Pim-3蛋白的表达无差异（P>0.05）。
　　（4）与未处理的A549细胞和对照siRNA组相比，Pim-3 siRNA组中肺腺癌A549细胞的增殖显著受到抑制（P<0.05），而未处理的肺腺癌A549细胞和对照siRNA组相比，A549细胞的增殖无差异（P>0.05）。
　　（5）Pim-3 siRNA组中G0/G1期的细胞数的比率（61.29±0.87%）显著高于未处理的A549细胞（46.76±1.58%）和对照siRNA组（48.37±0.87%），差异具有统计学意义（F=142.482，P=0.000）。此外，Pim-3 siRNA组中S期的细胞数的比率（25.05±1.22%）显著低于未处理的A549细胞（31.55±1.11%）和对照siRNA组（31.83±0.89%），差异具有统计学意义（F=37.756，P=0.000）。
　　（6）Pim-3 siRNA组中早期凋亡的细胞数比率（24.39±1.20%）显著高于未处理的A549细胞（7.02±0.60%）和对照siRNA组（7.39±0.34%），差异具有统计学意义（F=462.594，P=0.000），而未处理的A549细胞和对照siRNA组之间早期凋亡的细胞数比率无差异（P>0.05）。
　　（7）Pim-3表达下调显著降低肺腺癌A549细胞中STAT3的磷酸化水平，但不改变总的STAT3的表达。此外，Pim-3表达下调显著降低肺腺癌A549细胞中cyclin D1和Bcl-2的表达水平，但显著上调明显增加肺腺癌A549细胞中p21和Bax的表达水平。
　　结论
　　（1）Pim-3蛋白在肺腺癌中的高表达可能与肺腺癌的发生发展密切相关。
　　（2）Pim-3表达下调介导肺腺癌细胞增殖抑制、周期分布改变和诱导细胞凋亡。
　　（3）Pim-3表达下调可能与肺腺癌细胞中STAT3信号途径的活化状态密切相关。

目录

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声明

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中英文缩略词

前言

材料与方法

1实验材料

2实验方法

结果

1.肺腺癌组织和正常肺组织中Pim-3蛋白的表达

2. Pim-3蛋白表达与肺腺癌病人临床病理学参数的关系

3. 肺腺癌组织和肺正常组织中Pim-3蛋白表达分析

4. Pim-3蛋白在不同处理的肺腺癌A549细胞中的表达

5. Pim-3表达下调显著抑制肺腺癌A549细胞的增殖

6. Pim-3表达下调改变肺腺癌A549细胞周期分布

7. Pim-3表达下调诱导肺腺癌A549细胞凋亡

8. Pim-3表达下调阻断肺腺癌A549细胞中STAT3的磷酸化

9. Pim-3表达下调对肺腺癌A549细胞中STAT3途径中下游靶基因表达的影响

讨论

参考文献

全文结论

综述:PIM蛋白激酶的结构、功能及其在肿瘤发展和进展中的作用

1、PIM激酶家族概况

2、PIM激酶的表达

3、PIM激酶调控的底物

4、PIM激酶在肿瘤发生发展中的作用

5. 前景与展望

参考文献

个人简历、在学期间所发表的学术论文与研究成果

致谢