含有WW结构域的氧化还原酶的基因在骨肉瘤化疗中的作用

摘要

背景：WWOX基因是2000年Bednarek等人应用基因分离技术发现的位于人类普通的染色体脆性位点FRA16D（16q23.3-q24.1），共含有9个外显子，基因片段长度为1245bp，大致编码414个氨基酸，相对分子量为46000，WWOX蛋白含有两个N端的WW结构域(59-88及18-47)和一个C端的脱氢还原酶(SDR,121-330)位点,因此得名为包含氧化还原酶的WW域。目前文献中报道的已知的参与WWOX转录的mRNA共有8种，分别为：FOR1、FOR2、FOR3、FOR4、WWOXdelta5-8、WWOXisoform8、WWOXdelta6-8及全长。大量体动物实验证明裸鼠体内WWOX基因的缺失会诱发肺癌、肝癌等实体肿瘤的发生以及对紫外线、砷等致癌刺激的敏感性明显增加。最近的研究结果显示，WWOX基因在骨肉瘤、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、消化道肿瘤、前列腺癌等实体肿瘤中检测到其杂合性缺失及染色体重排，这就导致 WWOX基因无法发挥正常功能。相关文献报道在多种肿瘤细胞，如肺癌及乳腺癌细胞中发现5-8及6-8的连接错误及其他关于转录的异常，这些异常也就造成了WWOX基因外显子的缺失，从而影响其功能的发挥。而相当多研究表明WWOX基因与DNA的修复有着密切的关系，所以WWOX基因一旦发生基因缺失，DNA修复受阻，癌变的可能性就明显增加。大量国内外研究表明WWOX基因与P53、P73、E2F-1、AP-2γ及RUNX2等这些与细胞增殖凋亡、细胞周期、细胞分化、血管生成等密切相关的因子作用而发挥功能，这些都提示了WWOX基因作为抑癌基因的可能。随着关于 WWOX基因作用机制研究的深入，Kyle Kurek等人的实验发现 WWOX基因的表达在肺癌化疗前后有明显的差异性，这也说明WWOX基因可能在肿瘤的化疗中发挥一定的作用。骨肉瘤是目前最常见的恶性骨肿瘤，发病年龄以儿童及青少年为主，好发部位为膝关节及肩关节周围，有着病情进展快，复发及转移率高，预后差等特点。相关研究证明骨肉瘤的发生发展是一个多因素共同作用的结果。随着1976年Rosen等人提出的新辅助化疗（Neoadjuvant chemotherapy）的治疗方案的普及，不仅仅有近80％骨肉瘤患者能够得到保肢治疗，更使患者的5年生存率由以往单纯手术的20％提升到60％，大大提高了患者的生存质量。化疗是目前骨肉瘤治疗中最主要的非手术治疗方式。骨肉瘤化疗中常用的化疗药物有：顺铂、多西他赛、甲氨喋呤、环磷酰胺等，且临床上通常采用两种或两种以上化疗药物联合使用[21]。但临床上骨肉瘤的化疗中往往存在化疗不敏感性以及肿瘤耐药性等问题，导致治疗效果不理想，骨肉瘤化疗治疗后转移及复发的几率仍然较高。目前针对骨肉瘤的化疗临床上常采用多种化疗药物联合使用的方案，但效果仍然欠佳。关于骨肉瘤化疗耐药性的研究在国内外广泛的开展，Zhao等人研究发现骨肉瘤细胞转染一种新发现的基因类型Smac后，对化疗药物依托泊苷的敏感性增强；宁磊的研究发现低浓度茶多酚可以增加顺铂的化疗作用。
　　目的：探讨外源性含有WW结构域的氧化还原酶的基因(WWOX基因)转染骨肉瘤细胞系MG63后对化疗药物的增敏作用和化疗后WWOX基因的表达情况。
　　方法：用慢病毒转染法将WWOX重组真核表达质粒及空载质粒转染至MG-63细胞，分别建立稳定表达WWOX基因的MG63-WWOX过表达细胞系（WWOX-OE）及空载质粒细胞系（CON），然后CCK8法检测各组细胞的增殖，Annexin-V和PI双染法检测各组细胞的凋亡;RT-PCR和Western blot法检测各组WWOX基因的mRNA和蛋白水平的表达。
　　结果：WWOX-OE组与CON组在加入化疗药物（顺铂+多西他赛）处理后，结果显示WWOX-OE组与CON组相比增殖明显受抑制p=0.0159＜0.05，凋亡明显增多，差异性明显，p=0.0159＜0.05。RT-PCR和Western blot法结果显示化疗药处理后的WWOX-OE组与CON组WWOX的表达均明显增高，差异性明显，p=0.0079＜0.05。且RT-PCR结果显示化疗药处理后的WWOX-OE组较CON组WWOX的表达量更高，差异性明显，p=0.0079＜0.05。
　　结论：在骨肉瘤细胞MG63中，升高WWOX基因的表达可以增加化疗的敏感性，这也为研究骨肉瘤化疗不敏感及耐药开辟了新的思路。

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前言

材料与方法

1 实验材料

1.2 实验仪器及试剂

2 实验方法

2.1 材料

2.2 细胞培养及传代

2.3 稳定过表达WWOX基因的骨肉瘤MG-63细胞系的构建

2.4 化疗药的选取及浓度

2.5 实验分组

2.6 CCK8法检测化疗药作用后各组细胞增殖:

2.7 流式细胞仪检测化疗药作用后各组细胞凋亡

2.8 RT-PCR检测化疗药作用后各组WWOX基因的表达情况

2.9 Western检测化疗药作用后各组WWOX基因的表达情况

2.10 统计学方法分析数据

结果

1 转染效率的检测

2 细胞增殖cck8实验：

3 流式细胞仪Annexin V-PI 双染法检测细胞凋亡

4 各组化疗药作用后WWOX表达情况

4.1 RT-PCR

4.2 Western blot

附图

讨论

结论

参考文献

综述:WWOX基因、骨肉瘤及化疗的研究进展

个人简历及研究生期间发表的文章

致谢