ARK5在肝癌组织中的表达及对肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

摘要

肝细胞癌（HCC）为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，有研究报道HBV和HCV感染为HCC最主要的病因，在欧美等其他一些发达国家或地区，酒精性肝硬化以及与肥胖相关的非酒精性脂肪肝亦是造成罹患HCC的主要原因。恶性肿瘤的发生和发展通常是由体内外多种因素共同作用的多阶段参与的复杂过程。HCC的发生过程是由体内外多种因素以及多条信号通路共同作用的结果，尽管目前临床已广泛使用常规放疗以及化疗等技术有效控制了HCC的发生和发展，但大部分患者在接受上述疗法之后的预后情况依然不容乐观。靶向治疗是目前新发现的、能够有效治疗HCC的新途径，已成为基础肿瘤医学界研究的热点和难点内容。广大的医学工作者们正在试图寻找能够成为临床上有效治疗HCC的新靶点，以期为有效控制HCC和改善患者预后奠定基础。ARK5的异常表达与临床上多种恶性肿瘤的发生和发展存在密切联系，还与恶性肿瘤的侵袭和转移相关。目前研究已证实ARK5基因在人类的多种恶性肿瘤组织中存在高表达，特别是在一些侵袭和转移性较高的恶性肿瘤中，但其在HCC中表达研究相对较少。目前对于Akt(Protein Kinase B)在HCC发生和发展过程中如何调控ARK5与HCC肿瘤的增殖、凋亡以及侵袭过程中的相关机制的研究依然较少，TGF-β1(transforming growth factor-beta1)信号通路出现异常是恶性肿瘤发生、发展、浸润、转移等过程的重要因素，TGF-β1信号通路出现异常是恶性肿瘤发生、发展、浸润、转移等过程的重要因素。本研究拟观察ARK5在HCC患者肿瘤组织中的表达及意义，分析ARK5表达的变化对HCC肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭的影响，探究TGF-β1和Akt信号活化对HCC肿瘤细胞中ARK5表达的调控作用及其对HCC肿瘤细胞生物学行为的影响，旨在为了解HCC的发生和发展机制并为HCC的临床诊断及靶向治疗提供可靠依据。
　　目的：观察ARK5在肝细胞癌（HCC）患者肿瘤组织中的表达及意义，分析ARK5表达的变化对HCC肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭的影响，探究TGF-β1和Akt信号活化对HCC肿瘤细胞中ARK5表达的调控作用及其对HCC肿瘤细胞生物学行为的影响，旨在为了解HCC的发生和发展机制并为HCC的临床诊断及靶向治疗提供可靠依据。
　　方法：⑴运用荧光定量PCR对20例HCC组织以及相应癌旁正常组织样品中ARK5 mRNA的表达情况进行测定；运用western blot法检测HCC癌组织及其相应癌旁正常组织中 ARK5蛋白的表达；运用免疫组织化学法检测样品中 ARK5蛋白的表达；分析ARK5蛋白的表达与HCC患者临床病理参数以及患者生存率的相关性。⑵将siRNA-ARK5转染人肝癌细胞AMMC-7721，以此降低细胞中ARK5的表达；荧光定量PCR和western blot法检测转染后AMMC-7721细胞中ARK5 mRNA和相应蛋白的表达；运用MTT法检测转染后细胞的增殖活性；Annexin V-FITC/PI双染法检测转染对细胞凋亡的影响；用Transwe II小室法检测转染后细胞的侵袭能力；细胞划痕实验检测转染后对细胞迁移能力的影响；检测转染后细胞中Caspase-3活性。⑶将TGF-β1抑制剂Ly364947作用于人肝癌细胞AMMC-7721，以此降低细胞中TGF-β1的表达，BrdU细胞增殖实验检测细胞的增殖能力；用Transwe II小室法检测细胞的侵袭能力；细胞划痕实验检测细胞的迁移能力；western blot法检测细胞中TGF-β1、Akt、ARK5蛋白的表达。
　　结果：①ARK5 mRNA及其相应蛋白在HCC癌组织中的表达显著高于其在相应癌旁正常肝脏组织中的表达；ARK5高表达与HCC肿瘤大小、组织分化程度、肿瘤分期显著相关（P<0.05）；而与患者年龄、肝硬化、HBsAg、血清AFP无关（P>0.05）；ARK5蛋白表达能够作为HCC的一个独立预后判断因素。②转染siRNA-ARK5后AMMC-7721细胞中ARK5 mRNA和相应蛋白的表达显著降低（P<0.05）；siRNA-ARK5组AMMC-7721细胞的增殖活性显著低于siRNA-NC组和空白组，且siRNA-ARK5组细胞生长抑制率在48 h为最高，与siRNA-NC组相比差异显著（P<0.01）；转染48 h后，siRNA-ARK5组细胞的凋亡率明显增高，与空白组相比差异显著（P<0.01）；siRNA-ARK5组细胞的侵袭能力明显降低，与与空白组相比差异显著（P<0.05）；与空白组相比，siRNA-ARK5组细胞的迁移能力明显降低（P<0.01）；siRNA-ARK5组细胞的caspase-3活性较空白组明显增高。③TGF-β1抑制剂Ly364947作用于AMMC-7721细胞后，TGF-β1 inhibitor组细胞的增殖活性较对照组明显降低（P<0.01）；TGF-β1 inhibitor组细胞的侵袭能力较对照组明显降低（P<0.05）；TGF-β1 inhibitor组细胞的迁移能力较对照组明显降低（P<0.01）；TGF-β1被抑制后，细胞中的Akt和ARK5蛋白表达量较对照组显著下降。
　　结论：HCC组织中ARK5的表达与肿瘤大小、组织分化程度、肿瘤分期之间存在密切联系，这可能是与TGF-β1刺激Akt/ARK5信号转导通路促进了AMMC-7721细胞的增殖、侵袭和转移相关。

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前言

第一章 ARK5在HCC组织中的表达及意义

一 材料与方法

1 材料

2 方法

二 结果

1 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性

2 荧光定量PCR检测各样品中ARK5 mRNA表达

3 western blot检测各样品中ARK5蛋白表达结果

4 各样品组织切片中ARK5蛋白的表达情况

5 ARK5蛋白表达与患者生存率的相关性

三 讨论

四 小结

第二章 ARK5对肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭作用机制的研究

一 材料与方法

1 材料

2 方法

二 结果

1 转染后ARK5在AMMC-7721细胞中的表达

2 ARK5对AMMC-7721细胞增殖的影响

3 ARK5对AMMC-7721细胞凋亡的影响

4 ARK5对AMMC-7721细胞侵袭能力的影响

5 ARK5对AMMC-7721细胞迁移能力的影响

6 ARK5对AMMC-7721细胞Caspase-3活性的影响

三 讨论

四 小结

第三章 ARK5与肝癌细胞增殖和侵袭作用机制的研究

一 材料与方法

1 材料

2 方法

二 结果

1 RrdU细胞增殖实验结果

2 Transwe II小室法实验结果

3 细胞划痕实验结果

4 western blot检测结果

三 讨论

四 小结

参考文献

综述:原发性肝癌发生机制及其治疗的研究进展

个人简历、在学期间发表的学术论文与科研成果

致谢