癫痫持续状态幼鼠海马神经元凋亡及NGF的干预作用研究

摘要

背景：
　　癫痫持续状态(SE)是临床科室尤其是小儿神经内科十分常见的急症，国际抗癫痫联盟的传统定义一次癫痫持续30分钟以上，或反复多次发作持续30分钟，且发作间期意识不能恢复至发作前基线状态。相关动物实验证实,SE30分钟后脑神经就开始大量的死亡，而细胞凋亡是其主要的形式之一，细胞凋亡在脑神经元死亡的过程中扮演着极其重要的作用。
　　1972年Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念，根据细胞的超微结构的不同特征，把细胞死亡分为坏死和凋亡两种方式。早期对神经细胞凋亡的研究大多集中在神经元的正常发育过程。大量研究表明，神经元的凋亡与颅脑损伤后存活的细胞数目有着直接关系，并对脑损伤后的预后产生十分重要影响，因而进一步认识神经细胞的凋亡极具重要性。神经细胞的凋亡的发生与否主要取决于抗凋亡因素的抑制及凋亡诱导因素的激发这两方面的综合作用。半胱氨酸天冬酶家族（Caspase）的激活与抑制在细胞的凋亡的三条凋亡通路中都有涉及，该蛋白酶系统位于许多凋亡路径的交点，导致了凋亡细胞解体。抗凋亡蛋白家族中较为独特的是人类凋亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosisproteins,IAPs），其中的X-IAP是唯一可与凋亡启动因子Caspase-9及效应因子Caspase-3相结合的抗凋亡蛋白。亦有证据表明Caspase-9和Caspase-3的激活、细胞色素C的释放参与了脑缺血诱导的神经细胞凋亡。已有大量文献报道：神经生长因子（Nervegrowthfactor,NGF）对损伤后的神经功能恢复能起到积极促进的作用。韩贵和等研究发现：NGF对正常神经细胞凋亡有抑制作用，能够增强神经细胞的抗损伤能力。但是，针对SE致发育中脑损伤细胞凋亡的靶点开发特异性神经保护药物是世界众多神经科学研究人员关注的热点和努力的方向，目前国际国内并没有实质性突破。
　　目的：
　　本实验采用对幼鼠腹腔注射氯化锂、匹罗卡品建立氯化锂-匹罗卡品癫痫模型，观察各组实验幼鼠海马区神经细胞的病理形态改变及Caspase3、Caspase9和XIAP的表达的关系，并研究NGF对其干预作用，进而找到上游的靶点并为临床治疗提供理论依据。
　　方法：
　　1.将3~4周龄（25日龄）健康雄性SD幼鼠随机分为三大组，9个亚组。①正常对照组（normalgroup,NG）；模型组（statusepilepticsgroup,SG）：②SE后4h组,③SE后8h组,④SE后24h组,⑤SE后72h组；NGF组：⑥NGF后4h组,⑦NGF后8h组,⑧NGF后24h组,⑨NGF后72h组。
　　2．用TUNEL法检测不同时间点海马区的细胞凋亡，用SP免疫组化法检测海马区神经细胞Caspase3、Caspase9、XIAP的蛋白表达情况。
　　结果：
　　1.正常组偶见TUNEL阳性细胞，SE组8h后TUNEL阳性细胞表达开始明显增多,在72h达峰值。NGF组与SE组阳性细胞数的变化趋势基本相同,但其数量明显较SE组少。
　　2.正常对照组海马各区内仅见少量细胞核或胞浆黄染的阳性细胞表达；与对照组相比，SE组表达显著增多，随时间推移而增加，24h时染色深度及阳性细胞数目达高峰,其细胞排列明显较正常紊乱，细胞核固缩、破碎，72h时稍减少。NGF组的Caspase3变化趋势与SE组基本相同,在相应时间点较SE组均显著减少。Caspase9的表达及阳性细胞特点与Caspase3相似，在SE组其表达趋势及峰值亦基本一致，NGF组中Caspase9蛋白表达在24h、72h显著减少SE组。
　　3.XIAP海马区XIAP阳性细胞为细胞核或胞浆黄染，对照组偶见阳性细胞；SE组XIAP阳性细胞数目较对照组明显增多，染色程度较其加重，在4小时表达开始增多，8小时达到峰值，之后略减少；NGF组XIAP蛋白表达的趋势与SE组一致，但NGF组XIAP蛋白表达均显著多于SE组。
　　结论：
　　1.癫痫持续状态可引起海马区神经细胞的凋亡，在急性期内，随着时间的延迟，发生凋亡的细胞越多，脑损伤越重。
　　2.细胞凋亡的发生与caspase3、caspase9的激活有关，其激活可以导致细胞发生凋亡；当细胞凋亡发生时，XIAP因应激而表达，为抑制凋亡蛋白。
　　3.NGF可能通过下调细胞凋亡因子caspase3、caspase9的表达，增加抑制细胞凋亡因子XIAP的表达发挥着保护着中枢神经的作用。

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引言

1.癫痫持续状态概述

1 实验材料

1.1 主要实验试剂

1.2 实验动物

1.3 相关仪器

1.4 相关溶液的配置

2 实验方法

2.1 实验分组

2.2 SE模型制备

2.3处理

2.4标本处理和检测指标

3 结果

3.1 大鼠SE模型行为学观察

3.2 海马区神经细胞凋亡

3.3 海马区Caspase3蛋白表达

3.4 海马区Caspase9蛋白表达

3.5 海马区XIAP蛋白表达

4 讨论

结论

参考文献

综述:癫痫持续状态治疗进展

个人简历及在校期间发表论文

致谢