HPI-4对人上皮性卵巢癌A2780细胞增殖和凋亡的影响

摘要

背景与目的:卵巢癌致死率位居于女性生殖系统恶性肿瘤的第一位。其起病比较隐匿，缺乏相对特异性的临床症状、迅速实时和卓有成效的诊断手段和治疗方案。因此，它在被明确诊断时多已为晚期且往往预后不良。卵巢恶性肿瘤目前以手术为主要治疗方式。虽然辅以化学药物治疗、放射治疗及传统的中医药等，但最终的治疗效果往往并不十分理想。目前肿瘤相关的研究已逐步深入到了细胞、分子水平。卵巢癌发生发展的研究也不例外。其中，关于细胞间众多信号通路与恶性肿瘤发生发展的研究也已成为近年来的热点。
　　Hedgehog(Hh)信号通路，第一次是在对果蝇进行研究时发现的。我们是在对其胚胎体节发育调节的探索中认识了Hh信号通路。后来又在脊椎动物中证实存在并成功分离出了其中重要的相关基因。Hh信号通路，作为体内非常具有典范性的信号通道之一，不但与胚胎的发生发育有关联，还与组织更新有着极为密切的联系。它还在人类所熟知的多种恶性肿瘤的发生、发展中起了巨大作用。截止到目前相关研究表明：Hh信号通路，在宫颈癌、子宫内膜癌等中的影响及作用机制已有了一些较为深入的研究。当然，卵巢癌也不例外。人卵巢癌组织中也已经被发现：其内存在有明显的该通道的异常活化、相关蛋白的高表达。一些报道提出：Hh信号通路的异常激活在卵巢癌的发生、发展中起着重要的作用。抑制该通路可导致卵巢癌的细胞生长抑制及癌细胞的凋亡。这也得到相关的研究的证实。因此，Hh信号通路的抑制剂可能是卵巢癌有效的治疗途径之一。
　　GLI蛋白，其作为Hh通路的下游成员而被大家熟知。它不仅仅介导了多数的Hh信号通路，并且还在多种比较常见的肿瘤，如乳腺癌，胶质瘤等，都有异常的活化及增殖。已经被发现的并研究的Hh信号通道下游的小分子抑制剂有GANT61、GANT58和HPI系列等。它们均为通过抑制一个特殊的位点―GLI蛋白，来抑制恶性肿瘤细胞的生长。关于Hh信号通路在卵巢癌中的作用，目前研究多集中在上游位点。但是关于 GLI诱导因子介导的该通道的下游位点相关研究及报道较少。有研究称，HPI-4，作为一个下游小分子抑制剂，可能是通过抑制Hh通路的下游而发挥作用的。HPI-4抑制肿瘤细胞生长的机制可能是：抑制了该通路中初始纤毛细胞（具有感受器功能）。然而目前关于HPI-4在人上皮性卵巢癌中的研究国内外报道比较少，其具体的作用机制目前仍不十分明晰。
　　几乎所有的肿瘤细胞中都可以见到细胞周期调节的紊乱及失调控的现象。所以说，肿瘤就是一种细胞周期失去调节的特殊疾病。细胞周期蛋白D1(CyclinD1)，是特别重要的核内调节蛋白之一，其存在于细胞周期中。它的过度表达可导致G1/S检测点G1/S的缺陷，并且在G1期间隔变短的情况下使细胞顺利越过G1/S限制点。在这种情况下细胞的抗增殖功能就消失了，最终变为我们所知道的异常细胞。这些不受细胞周期调控的异常细胞，出现增殖、不断累积，最终会引起癌变。因此，CyclinD1蛋白，异常表达于细胞周期失控中，进一步发展成为细胞异常增殖。其在导致癌变的发生过程中发挥着重要作用。
　　本研究拟观察HPI-4对A2780细胞增殖、凋亡的影响，及其对CyclinD1、GLI1蛋白表达的影响。以进一步探讨：Hh信号通路，参与卵巢癌发生发展可能的机制。本研究不仅给临床卵巢癌的靶向治疗提供了一个新的靶向药物选择，也为小分子抑制剂HPI-4在卵巢癌中的进一步研究夯实了可靠的理论基础。
　　材料与方法:复苏和培养人上皮性卵巢癌A2780细胞，至对数生长期。首先用MTT法分别检测不同浓度、不同时间下Hh信号通路抑制剂HPI-4作用下A2780细胞的抑制率。然后通过流式细胞仪测定不同浓度下 HPI-4对人上皮性卵巢癌A2780细胞作用48小时后对细胞周期分布及凋亡的影响。最后采用免疫印迹检测CyclinD1和GLI1在人上皮性卵巢癌 A2780细胞的表达情况，以及受到不同浓度HPI-4作用48小时后的两者表达有无改变。
　　采用SPSS20.0统计软件包分析相关实验数据，以α=0.05作为检验水准。
　　结果:
　　1、MTT法实验结果显示：Hh通路抑制剂HPI-4作用于A2780细胞后，细胞增殖受到明显抑制。且随着 HPI-4浓度的增加，作用时间的延长，其对A2780细胞增殖抑制率逐渐增加，呈现浓度和时间依赖性。
　　2、流式细胞仪检测结果显示：HPI-4作用于人上皮性卵巢癌A2780细胞48h后，细胞周期分化受到明显抑制，细胞凋亡率明显增高。且随着 HPI-4浓度的增加，G0~G1期细胞百分比也逐渐增加。S期细胞百分比逐渐减少，进入DNA合成期的细胞逐渐减少。且细胞凋亡率逐渐升高，呈现浓度依赖性。G2/M期的百分比则无显著性差异。
　　3、免疫印迹结果显示：CyclinD1和GLI1在人上皮性卵巢癌 A2780细胞中高表达。加入药物HPI-4后CyclinD1和GLI1蛋白表达均下降，且随着药物浓度的增加而逐渐下降，呈现浓度依赖性。
　　结论:
　　1、HPI-4可以抑制体外培养的人上皮性卵巢癌A2780细胞增殖，且呈剂量、时间依赖性；
　　2、HPI-4对A2780细胞的作用主要表现为阻止DNA合成和诱导细胞凋亡；
　　3、上皮性卵巢癌A2780细胞中CyclinD1、GLI1蛋白异常表达与Hh信号通路的异常激活有关。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩略词中英文对照表

前言

材料与方法

1.1 细胞株

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

1.4 试剂配制

1.5 实验方法

1.6 统计学方法

结果

2.1 HPI-4对A2780细胞增殖的影响

2.2 HPI-4对细胞周期分化和凋亡的影响

2.3 HPI-4对CyclinD1、GLI1蛋白表达水平的影响

讨论

3.1 Hh信号通路抑制剂HPI-4对人上皮性卵巢癌A2780细胞的作用

3.2 HPI-4对人A2780细胞周期和凋亡的作用

3.3 HPI-4对CyclinD1、GLI1蛋白表达水平的影响

结论

参考文献

综述: Hedgehog信号通路及其抑制剂研究进展

参考文献

个人简历

致谢