毛叶香茶菜素F对人食管癌EC9706细胞生长的抑制作用及其机制初步研究

摘要

背景和目的
　　食管癌是最常见的消化道疾病之一，其死亡率几乎与胃癌相当，治疗效果较差，5年存活率还不足10％，严重威胁着人类健康。食管癌分为食管鳞癌和食管腺癌，我国以食管鳞癌居多，食管腺癌较少，尤其是河南安阳、林州等地是食管癌的高发地区。目前食管癌还没有特效治疗药物，而且其治疗方案的选择也与发病时期有关，处于发病早期和部分中期的患者可以采用手术治疗，而晚期患者只能采用放化疗方案，并且效果都不是特别理想。
　　毛叶香茶菜是唇形科植物，主要含有二萜、三萜、木质素和黄酮类等化合物，已有体内外研究表明，毛叶香茶菜素A、G和E在体外对艾氏腹水癌(ECA)的增殖具有明显的抑制作用，在体内同样表现出一定的抗肿瘤效应，毛叶香茶菜素B对L1210白血病小鼠模型的生命延长表现出可观的效果，毛叶香茶菜素C和D则没有抗肿瘤作用。目前对毛叶香茶菜素F的研究较少，关于其对食管癌的作用文献中尚未见报道，本研的目的在于初步探讨毛叶香茶菜素F对人食管癌EC9706细胞增殖的抑制作用及机制。
　　材料和方法
　　1. MTT法粗测样品活性以食管癌 EC9706细胞为模型，试验组分别加100、80、50、40、30μg/ml的毛叶香茶菜素F样品，阴性对照组加相同体积的完全培养基，在37℃5%的CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h后每孔加20μl MTT溶液，继续培养4h后吸掉上清并每孔加入160μl DMSO，用酶标仪检测吸光度。
　　2.观察样品对细胞生长状态的影响试验组分别加入80、50、40、30μg/ml的毛叶香茶菜素F样品，阴性对照组加相同体积的完全培养基，在37℃5%的CO2培养箱中培养72h后在显微镜下观察细胞生长状态并拍照。
　　3.细胞划痕试验阴性对照组不加药，试验组分别加入50、40、30μg/ml的毛叶香茶菜素F样品，阳性对照组加入50μg/ml顺铂，作用24h后，在显微镜下观察、取样、拍照并测量各划痕区域的面积。
　　4. Hoechst/PI细胞凋亡检测试验组分别加入80、50、40、30μg/ml的毛叶香茶菜素F样品，阴性对照组加相同体积的完全培养基，在37℃5%的CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h后加入荧光染料，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　5.细胞周期检测试验组分别加入50、40、30μg/ml的毛叶香茶菜素F样品，阴性对照组加相同体积的完全培养基，在37℃5%的CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h后加入荧光染料，然后用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。
　　6. Western blot检测样品对EC9706细胞中5种蛋白表达的影响试验组按照50、40、30μg/ml的浓度加入毛叶香茶菜素F样品，阴性对照组加相同体积的完全培养基，在37℃5%的CO2培养箱中分别培养72h后，提取相关蛋白，用Western blot方法检测毛叶香茶菜素F作用后Bax、Bcl-2、Caspase-3、mTOR及P53五种蛋白表达水平的变化。
　　7. SPSS统计学处理采用统计学处理软件SPSS17.0，数据资料采用x±s的表示形式，每组试验均重复三次以上。
　　结果
　　1. MTT法检测结果显示，毛叶香茶菜素F作用24h、48h和72h后对EC9706细胞的生长均表现出明显的抑制作用，其IC50分别为46.7μg/ml、25.4μg/ml和20.6μg/ml，且随着浓度的增大和时间的延长抑制作用也呈增强的趋势。
　　2.试验组在不同浓度的毛叶香茶菜素F样品作用72h后与对照组相比，细胞体积变小，细胞质皱缩，呈较小的颗粒状。
　　3.在细胞划痕试验中，毛叶香茶菜素F终浓度为50μg/ml组细胞培养24h后划痕面积约为3.10×105，与对照组2.52×105相比明显增大，并且差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　4.当浓度为50μg/ml时，毛叶香茶菜素F作用24h、48h和72h后细胞凋亡率约分别为20.20%、21.65%和53.21%，当作用时间为72h，随着浓度的增大细胞凋亡率分别为10.37%、17.84%、53.21%和86.63%，；当浓度为50μg/ml时，毛叶香茶菜素F作用24h、48h和72h后细胞周期G1期细胞比例分别为58.53%、57.37%和52.37%，S期细胞比例分别为40.06%、41.16%和45.62%，当作用时间为72h，随着浓度的增大G1期细胞比例分别为59.65%、56.43%和52.37%，S期细胞比例分别为39.71%、42.35%和45.62%，均呈时间和浓度依赖性，且组间差异具有统计学意义（P＜0.05），G2期细胞无明显变化。
　　5.毛叶香茶菜素F对EC9706细胞5种蛋白表达水平的影响毛叶香茶菜素F作用72h后，随着浓度的增大，Bax蛋白灰度值分别为0.91、1.20和1.26、Caspase-3蛋白灰度值分别为0.77、0.83和1.11，而Bcl-2蛋白灰度值分别为1.01、0.95和0.92，mTOR蛋白灰度值分别为1.08、0.84和0.71，P53（突变型）蛋白的灰度值分别为0.94、0.72和0.58，与对照组相比发现其可以上调 Bax和Caspase-3蛋白的表达、下调Bcl-2、mTOR及P53（突变型）蛋白的表达。
　　结论
　　毛叶香茶菜素F可以上调Bax、Caspase-3蛋白的表达水平，下调Bcl-2、mTOR及P53（突变型）蛋白的表达水平，能够抑制食管癌 EC9706细胞的增殖、迁移，将细胞生长阻滞于S期，促进细胞的凋亡，这些可能是毛叶香茶菜素F产生抗肿瘤作用的机制之一。

目录

声明

缩写词对照表

引言

一 材料和仪器

1 细胞系

2 试验样品

3 主要试验试剂

4 主要试验仪器

二 试验方法

1 细胞培养

2 检测方法

三 结果

1. 毛叶香茶菜素F对EC9706细胞增殖的抑制作用

2. 光学显微镜下观察毛叶香茶菜素F对EC9706细胞生长状态的影响

3. 毛叶香茶菜素F对EC9706细胞迁移能力的影响

4. FITC-Annerxin V/PI 双染法检测EC9706细胞凋亡率

5. PI 单染法检测EC9706细胞周期

6. 毛叶香茶菜素F对EC9706细胞5种蛋白表达水平的影响

四 讨论

五 结论

参考文献

综述:食管癌治疗的现状与展望

个人简历

致谢