GSK-3β通过RNA结合蛋白HuR-TTP参与高糖诱导的足细胞炎症因子表达及损伤

摘要

背景: 糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）已超过肾小球肾炎成为终末期肾脏病（end-stage renal disease，ESRD）的首要原因。作为糖尿病严重的微血管并发症，糖尿病肾病的发生也往往同时合并其他器官或系统的微血管病，如糖尿病视网膜病变和外周神经病变，极大程度影响患者生存时间和生活质量，也给国家医疗和患病家庭带来巨大社会和经济负担。因此，研究糖尿病肾病发病机制对糖尿病肾病的预防和治疗，对提高糖尿病肾病患者的生活质量都具有重要意义。 肾小球滤过屏障对维持肾脏正常过滤功能至关重要，主要由血管内皮细胞、基底膜和足细胞等构成。其中足细胞形态及功能损伤在糖尿病肾病的发生、发展过程中起到了关键的作用，而炎症是造成糖尿病肾病足细胞损伤的罪魁祸首之一。糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）是一种丝/苏氨酸磷酸激酶，在细胞活动和功能调节中起重要作用，参与多种细胞通路调控，影响细胞的增殖、分化、凋亡。有研究报道，在糖尿病肾病患者的肾组织中，GSK-3β的表达量和活性明显上调。锌指蛋白36（Tristetraprolin，TTP）是一种哺乳动物体内广泛分布的RNA 结合蛋白，可直接与多种炎性因子的mRNA 3’UTR区结合，介导mRNA的降解。研究表明，TTP能够被GSK-3β磷酸化，是GSK-3β的作用底物之一。我们的研究已经证实，在糖尿病肾病患者的血尿标本中，TTP的表达明显减少。人抗原R(Human antigen R，HuR)也是一种典型的RNA结合蛋白，它通过增加与其结合的mRNA稳定性，促进基因表达，在多种信号通路里发挥重要作用。近年来对肿瘤、心血管、免疫疾病的研究中发现，COX-2、TNF-α等炎症因子的mRNA均受到HuR-TTP轴的调节。值得注意的是，在一项大肠癌的研究中发现，HuR-TTP能够共同调节Claudin-1的表达水平，作为近年来新发现的肾损伤标志物，Claudin-1 广受研究中关注。然而在足细胞中GSK-3β对TTP和HuR表达的影响，以及HuR和TTP对足细胞炎症反应及损伤的影响，国内外尚未见报道。本实验旨在探究GSK-3β通过调节HuR-TTP参与高糖诱导的足细胞炎症因子表达及损伤的机制。 目的: 通过明确GSK-3β对HuR和TTP的调控作用，以及HuR-TTP的表达对足细胞损伤和炎症反应的影响，研究高糖环境下足细胞GSK-3β通过调节HuR-TTP参与足细胞炎症因子表达及损伤的机制。 方法: 本研究选取条件永生化小鼠足细胞作为研究对象。1.检测高糖刺激下足细胞的炎症因子表达及损伤情况。 将分化成熟的小鼠足细胞随机分为三组：正常糖浓度组(5.6 mmol/LD-葡萄糖)、高糖组（30 mmol/L D-葡萄糖）以及高渗对照组（5.6 mmol/LD-葡萄糖+44.4 mmol/L甘露醇）。采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测Nephrin、IL-17、Claudin-1和Cleaved caspase-3蛋白的表达，免疫荧光法观察Nephrin、IL-17、细胞骨架蛋白F-actin的定位和表达。 2. 明确足细胞中HuR和TTP的表达对Claudin-1及IL-17的影响。 对正常糖浓度组的小鼠足细胞分别转染 TTP 和 HuR的小干扰 RNA 片段（siTTP和siHuR），以下调TTP和HuR的表达；并设立转染对照组，对其转染一个无干扰效率的RNA片段（Scramble RNA）。Western blot和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分别检测 TTP、HuR、Nephrin、Claudin-1、IL-17、Cleaved caspase-3蛋白和mRNA的表达情况。 3. 明确高糖条件下HuR和TTP的表达对足细胞炎症反应和损伤的影响。 （1）Western blot法分别在正常糖浓度和高糖条件下检测TTP和HuR的蛋白表达量。 （2）分别对正常糖浓度组的小鼠足细胞转染过表达TTP的慢病毒，对高糖组转染HuR siRNA以下调HuR的表达，并设立空载病毒对照组和siRNA转染对照组。运用Western blot和qRT-PCR法分别检测TTP、HuR、Nephrin、Claudin-1、IL-17和Cleaved caspase-3蛋白和mRNA的表达。 4. 明确高糖环境下GSK3β通过调节HuR-TTP参与足细胞炎症反应和损伤。 （1）Western blot法检测正常糖浓度和高糖刺激下GSK-3β及pSer9GSK-3β的表达水平。 （2）用细胞免疫荧光法观察在正常糖浓度下和高糖条刺激下小鼠足细胞GSK3β、TTP和HuR的表达及定位，并运用免疫共沉淀技术明确，GSK3β是否能够分别与TTP和HuR结合。 （3）对正常糖浓度培养的小鼠足细胞转染过表达GSK-3β的S9A质粒，并对高糖环境下的小鼠足细胞转染GSK-3β siRNA以下调GSK-3β的表达；分别设质粒转染对照组和siRNA转染对照组，应用Western blot法检测相关蛋白和mRNA的表达。 结果: 1. Western-blot 结果显示：高糖刺激下足细胞损伤明显，表现为标记蛋白Nephrin表达减少，IL-17、Cleaved caspase-3和Claudin-1的蛋白表达量明显下调，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。免疫荧光结果表明，与正常糖浓度比，高糖环境下Nephrin表达明显减少；Claudin-1表达明显增多，细胞骨架蛋白F-actin完整性破坏，差异有统计学意义。 2. Western blot结果显示：与正常糖浓度组相比，下调TTP表达，足细胞损伤及炎症明显发生，表现为Claudin-1、IL-17、Cleaved caspase-3蛋白的表达增多；下调HuR表达，Claudin-1、IL-17、Cleaved caspase-3蛋白的表达减少；mRNA结果与Western blot一致，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 3. Western-blot结果显示：高糖刺激下，小鼠足细胞TTP蛋白的表达减少，HuR蛋白表达增多（P＜0.05）。分别对正常糖浓度组的小鼠足细胞转染过表达TTP慢病毒，对高糖组的足细胞转染HuR siRNA后，Western blot结果显示：与高糖组相比，上调 TTP 表达，足细胞损伤缓解，表现为 Nephrin 表达增加，Claudin-1、IL-17、Cleaved caspase-3表达水平下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与高糖组相比，下调 HuR 表达，足细胞损伤和炎症明显缓解，mRNA结果与Western blot一致，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 4. （1）高糖刺激下 GSK-3β 表达增加，pSer9GSK-3β 表达减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。（2）免疫荧光结果显示，GSK-3β 分别与 TTP 和HuR 具有共定位。免疫共沉淀结果表明，足细胞 GSK-3β 蛋白能够分别与 TTP蛋白和HuR蛋白结合。高糖刺激下，GSK-3β蛋白与TTP蛋白结合减少，与HuR蛋白结合增多。（3）上调正常糖浓度GSK-3β的表达，TTP表达减少，HuR表达增加，足细胞炎症和损伤明显，表现为Claudin-1、IL-17、Cleaved caspase-3蛋白表达水平增加，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。下调高糖环境GSK-3β表达，足细胞损伤及炎症反应明显缓解。mRNA结果与Western blot一致（P＜0.05）。 结论: 1.HuR和TTP能够调节Claudin-1及IL-17的表达，并参与高糖诱导的小鼠足细胞炎症反应和损伤。 2. 小鼠足细胞中GSK3β能够与HuR和TTP结合并调节其表达。 3. 高糖环境下GSK3β通过调节HuR-TTP参与炎症因子IL-17的表达及足细胞损伤。

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