MiR-137调控电压门控钾离子通道Kv1.2参与神经病理性疼痛

摘要

背景 神经病理性疼痛是指由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛，表现为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛和感觉异常等临床特征，严重降低了患者的生活质量。目前临床上多以药物治疗为主，但治疗效果并不理想且产生明显的副作用，极需我们进一步研究探讨其机制，为治疗提供新的思路和方法。 离子通道异常与神经病理性疼痛有密切的联系，其中钾离子通道在维持静息膜电位，介导动作电位的快速复极化以及调节神经元兴奋性中起重要作用。我们的预实验结果显示电压门控钾离子通道Kv1.2在CCI模型中表达水平显著下降，涉及Kv1.2下调的机制有很多，但有关表观遗传学机制研究甚少。 MicroRNAs（miRNAs）可通过与靶基因3’UTR端序列的完全或不完全配对抑制其靶蛋白的表达，在基因表达的转录后调节中发挥着重要作用，属于表观遗传机制的一种。近年来随着研究的不断深入，miRNAs逐渐成为疼痛治疗的一个新方向。生物信息学软件（Target Scan Human 7.1）发现miR-137与KCNA2 （Kv1.2基因）的3’UTR端存在碱基互补序列，暗示KCNA2很可能是miR-137的靶标。 由此提出本研究的假设：在正常生理状态下，内源性 miR-137 表达较低，对KCNA2 mRNA的抑制作用较弱使得Kv1.2表达水平保持稳态；当外周神经受损时，miR-137的增高抑制Kv1.2蛋白的翻译，Kv1.2表达减少，神经元兴奋性增加，从而引起神经病理性疼痛。 目的 本研究采用坐骨神经慢性压榨（chronic constriction injury，CCI）神经病理性疼痛模型，探索Kv1.2及内源性miR-137在CCI模型中的变化，评估miR-137是否对Kv1.2具有调控作用，阐明Kv1.2在CCI神经病理痛模型中下调的机制，为神经病理痛的治疗提供新的靶点和理论依据。 方法 （1）建立CCI大鼠神经病理痛模型，检测术后3d,7d,10d,14d双侧后爪的机械痛阈和热痛阈等行为学变化。 （2）全细胞电压钳记录方法比较sham组大鼠和CCI大鼠L4-L6 DRG内的总电压门控钾电流与 TEA 敏感电压门控钾电流强度（中等直径和大直径神经元）。 （3）western-blot和q-PCR比较Kv1.2在对侧和术侧组织中（CCI3d大鼠的脊髓和DRG）的mRNA及蛋白表达水平，检测Kv1.2的mRNA及蛋白表达在CCI中的变化趋势（术后3d，7d,14d）。 （4）正常大鼠鞘内注射KCNA2的siRNA，检测机械痛阈和热痛阈等行为学，western-blot检测脊髓和DRG组织中Kv1.2的蛋白表达。 （5）免疫荧光检测Kv1.2在DRG中的表达分布情况。 （6）q-PCR检测miR-137在CCI术后3d，7d,14d的表达水平。 （7）利用双荧光素酶报告基因检测Kv1.2和miR-137是否具有靶标关系，即miR-137能否直接作用KCNA2的3’UTR端。 （8）正常原代DRG细胞转染miR-137agomir和N.C，收集细胞做western-blot检测Kv1.2的蛋白表达；TNF-α刺激的DRG原代细胞转染miR-137antagomir和inhibitor N.C后检测Kv1.2的蛋白水平，评估miR-137对Kv1.2是否具有细胞水平的调控作用。 （9）正常大鼠鞘内注射miR-137agomir和N.C，行为学检测给药后机械痛阈和热痛阈的变化，全细胞电压钳记录方法检测大鼠DRG神经元中总的电压门控钾电流与TEA敏感的电压门控钾离子通道的电流强度，western-blot检测脊髓和DRG组织中Kv1.2的蛋白表达情况。 （10）CCI大鼠鞘内注射miR-137antagomir和inhibitor N.C，检测机械痛阈和热痛阈等行为学表现，全细胞电压钳记录检测给药后大鼠DRG神经元中总的电压门控钾电流与TEA敏感的电压门控钾电流的强度，western-blot检测Kv1.2的蛋白表达情况，评估miR-137在体对Kv1.2的调控作用。 结果 （1）与基础痛阈值相比，CCI大鼠在术后第3天术侧后爪的机械痛阈和热痛阈降低（P<0.001），持续到第14天，第7天痛阈值最低；对侧的痛阈值没有明显变化（P>0.05）。Sham组大鼠痛阈值稳定在正常水平，证明CCI模型建造成功。 （2）与sham组相比，CCI大鼠L4-L6的DRG神经元中总的电压门控钾电流与TEA敏感的钾离子通道电流降低。 （3）与对侧相比，CCI3d 大鼠术侧的脊髓和 DRG组织中 Kv1.2表达明显降低，无论是mRNA水平还是蛋白水平。与sham组相比，CCI3d,7d,14d大鼠脊髓和DRG组织中Kv1.2的mRNA和蛋白水平都降低了。 （4）正常大鼠鞘内注射siKCNA2后双侧后爪的机械痛阈和热痛阈均降低，western-blot检测到脊髓和DRG中的Kv1.2蛋白也减少了（P<0.001），再次验证了Kv1.2和疼痛的紧密关系。 （5）免疫荧光结果显示，在DRG组织中 Kv1.2 大部分表达在大，中神经元细胞，少部分表达在肽能神经元细胞，而与中，小神经元细胞标记物 IB4 不共标。 （6）与sham组相比，CCI3d,7d,14d大鼠脊髓和DRG组织中的miR-137表达增加。 （7）PC12细胞共转染野生型KCNA2载体和miR-137agomir后KCNA2的荧光素酶活性降低（P<0.01），而共转染突变型KCNA2载体和miR-137agomir后KCNA2的荧光素酶活性没有变化（P >0.05），表明miR-137可特异性地作用在KCNA2的3’UTR端。 （8 ）正常 DRG 原代细胞转染 miR-137agomir 和 N.C ，收集细胞做 western-blot，结果显示：与Na?ve组相比，Na?ve+miR-137agomir组的Kv1.2蛋白表达水平降低（P=0.0042）；Na?ve+N.C 组的Kv1.2 蛋白表达没有明显变化（P>0.05）。 （9）TNF-α刺激的DRG原代细胞转染miR-137antagomir和inhibitor N.C，收集细胞做western-blot，结果显示：与Na?ve组相比，TNF-α组的Kv1.2蛋白表达明显降低（P<0.001）。与TNF-α组相比，TNF-α+miR-137antagomir组的Kv1.2蛋白明显回升（P=0.0035）；TNF-α+inhibitor N.C组没有显著变化（P>0.05），表明miR-137对Kv1.2具有细胞水平的调控作用。 （10）正常大鼠鞘内注射miR-137agomir和N.C，结果显示：与Na?ve组相比，Na?ve+miR-137agomir 组大鼠双侧后爪的机械痛阈和热痛阈均明显降低，DRG神经元中总的电压门控钾电流与TEA敏感的钾离子通道电流均降低，脊髓和DRG中的Kv1.2蛋白表达减少（P<0.05）；Na?ve+N.C组大鼠的行为学及Kv1.2蛋白表达没有明显变化（P>0.05）。 （11）CCI大鼠鞘内注射miR-137antagomir和inhibitor N.C，结果显示：与CCI 组相比，CCI+miR-137antagomir 组大鼠术侧后爪的机械痛阈和热痛阈明显回升，对侧没有变化；DRG 神经元中 TEA 敏感的电压门控钾电流回升，术侧DRG中的Kv1.2蛋白表达回升（P<0.05）；而CCI+inhibitor N.C组行为学及Kv1.2蛋白表达没有显著变化（P>0.05）。 结论 MiR-137和Kv1.2是参与CCI诱发的神经病理痛的重要分子，miR-137通过结合KCNA2 3'UTR端来调控Kv1.2的表达，进而影响神经病理性疼痛。

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