p53途径在MC-LR致大鼠睾丸支持-生精共培养细胞凋亡中的作用

摘要

目的: 探究p53依赖途径是否参与调控微囊藻毒素-LR诱导SD大鼠睾丸支持-生精共培养细胞凋亡过程，线粒体在发生凋亡过程中又发挥怎样的作用？通过检测细胞凋亡率、细胞中线粒体膜电位、p53依赖途径凋亡相关蛋白及线粒体外膜蛋白VDAC1等，验证p53依赖途径及线粒体在微囊藻毒素-LR诱发SD大鼠睾丸支持-生精共培养细胞凋亡过程中的作用，为微囊藻毒素-LR 诱导的生殖毒性提供新的分子机制和理论基础。 方法: 1.原代睾丸支持-生精共培养细胞提取和培养：选取22天SD雄鼠，分离睾丸，提取睾丸支持-生精细胞，建立睾丸支持-生精共培养细胞体系。 2.细胞增殖抑制率检测：不同浓度MC-LR（0，1，5，10，20，40，60μg/mL）染毒睾丸支持-生精共培养细胞24 h后，采用CCK-8试剂盒测定各浓度组细胞增殖抑制情况，并计算出MC-LR作用于睾丸支持-生精共培养细胞24 h半数抑制浓度IC50，选取实验所用浓度为IC50、1/2IC50及1/4IC50。 3.细胞凋亡率测定：采用 AnnexinV-FITC/PI 染色法和流式细胞术检测各浓度MC-LR组及MC-LR+相应抑制剂（PFT-α和CsA）组睾丸支持-生精共培养细胞凋亡率变化。 4.细胞线粒体膜电位检测：各浓度MC-LR组及MC-LR+相应抑制剂（PFT-α和CsA）组染毒睾丸支持-生精共培养细胞24 h后，JC-1法结合流式细胞仪测定各组细胞线粒体膜电位有何变化。 5.分离提取细胞中线粒体：各浓度MC-LR组及MC-LR+相应抑制剂（PFT-α和CsA）组作用睾丸支持-生精共培养细胞24 h后，采用线粒体分离试剂盒分离睾丸支持-生精共培养细胞中线粒体，用于下一步提取线粒体和细胞浆蛋白。 6.凋亡相关蛋白检测：Western blotting法检测各浓度MC-LR组及MC-LR+相应抑制剂（PFT-α和CsA）组睾丸支持-生精共培养细胞中p53、PUMA、p21、MDM2及Cytc等蛋白相对表达水平。 7.VDAC1 mRNA水平测定：采用Real time-PCR检测各浓度MC-LR组及MC-LR+CsA组睾丸支持-生精共培养细胞中VDAC1在mRNA水平相对表达量。 结果: 1.MC-LR染毒睾丸支持-生精共培养细胞24 h后，除1 μg/mL浓度组，MC-LR 均能抑制睾丸支持-生精共培养细胞增殖。MC-LR浓度越大，对睾丸支持-生精共培养细胞增殖越明显，与对照组相比，差异具有显著性（P<0.05）。经计算，MC-LR作用于睾丸支持-生精共培养细胞IC50为36 μg/mL，所选实验浓度分别为36μg/mL、18 μg/mL和9 μg/mL。 2.不同浓度MC-LR（0,9，18，36 μg/mL）作用睾丸支持-生精共培养细胞24 h后，均可诱导睾丸支持-生精共培养细胞出现凋亡，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。MC-LR浓度越大，细胞凋亡率越高。在36 μg/mL浓度组预先2 h进行PFT-α或CsA处理后，细胞凋亡率与单独36 μg/mL MC-LR组相比，有明显降低，差异具有显著性（P<0.05）。 3.不同浓度MC-LR（0,9，18，36 μg/mL）染毒睾丸支持-生精共培养细胞24 h后，与对照组相比，可明显降低细胞线粒体膜电位水平（P<0.05），随MC-LR浓度增加，线粒体膜电位下降越明显。在36 μg/mL浓度组提前2 h进行PFT-α或CsA预处理后，细胞线粒体膜电位水平与单独36 μg/mL MC-LR组相比，有明显升高，差异具有显著性（P<0.05）。 4.不同浓度MC-LR（0,9，18，36 μg/mL）作用睾丸支持-生精共培养细胞24 h后，可显著促进p53依赖途径促凋亡蛋白p53、PUMA、P21、clevead PARP及clevead caspase-3相对表达水平，降低MDM2蛋白表达水平，与对照组相比，差异具有显著性（P<0.05）。在36 μg/mL浓度组提前2 h进行PFT-α预处理，与单独36 μg/mL MC-LR组相比，可明显抑制p53、PUMA、P21、clevead PARP及clevead caspase-3的蛋白相对表达，同时抑制Cytc从线粒体释放到细胞质。 5.不同浓度MC-LR（0,9，18，36 μg/mL）染毒睾丸支持-生精共培养细胞24 h后，可明显上调线粒体外膜蛋白VDAC1在蛋白和mRNA表达水平（P<0.05）。在36 μg/mL浓度组提前2 h进行CsA预处理，与单独36 μg/mL MC-LR组相比，可显著抑制Cytc从线粒体释放到细胞质（P<0.05），但对VDAC1蛋白相对表达无明显抑制作用。 结论: 1. p53依赖途径介导MC-LR致大鼠睾丸支持-生精共培养细胞凋亡过程 2.MC-LR诱导大鼠睾丸支持-生精共培养细胞mPTP开放，促进Cyt c释放 3.细胞周期阻滞可能参与了大鼠睾丸支持-生精共培养细胞凋亡的发生

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