ATO对SAA患者外周血中CD4+CD25+CD127low调节性T细胞比例的调节作用

摘要

再生障碍性贫血（Aplastic Anemia，AA）是一种以全血细胞减少为特征的血液系统疾病，与欧美国家相比，亚洲国家的发病率较高，约为（3.9-5.0）/106。AA的临床特征主要表现为不同程度的贫血、出血和感染，大多数患者无肝、脾、淋巴结肿大，其发病机制与多种体内外因素有关。目前，多数的学者认为免疫异常对于AA的发病机制具有重要作用，有些学者甚至认为造血微环境与造血干/祖细胞的改变正是由于异常的免疫损伤所致，且在临床实践上免疫抑制剂治疗AA有较好的效果，也为该论点提供了有力的证据。AA免疫异常表现在多个方面，包括T淋巴细胞数量、亚群比例及细胞因子等的变化。 在免疫系统中，CD4+T 淋巴细胞及其分泌的效应因子是机体发挥免疫效应的关键，在免疫应答的启动和效应阶段均发挥重要作用。有研究显示，经初始的CD4+T细胞分化来的CD4+CD25+CD127low调解性T细胞（Regulatory T Cell，Treg）亚群是一种具有免疫抑制和能够诱导免疫耐受的Ｔ细胞亚群，在维持免疫系统功能正常方面发挥重要作用。此亚群能够通过分泌具有抑制性功能的细胞因子，如IL-10、TGF-β以及其他类型的膜表面抑制分子，最终可抑制细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte，CTL）和辅助性T细胞（Helper T Cell，Th）的增殖与活化，在调节 T 细胞的免疫应答、维持免疫耐受、防止自身性免疫性疾病的发生以及肿瘤免疫等多方面发挥重要功能。鉴于此，越来越多的关于AA发病机制的研究聚焦于 Treg 数量及比例的异常。有研究结果显示，AA 患者外周血及骨髓中Treg数量及比例较健康人群均减少，可能正是由于Treg数目及比例的减少，导致其分泌的免疫负调控因子（IL-10、IL-35、转化生子因子β（TGF-β））减少，机体维持免疫耐受的能力降低，从而细胞免疫亢进，自身反应性Ｔ淋巴细胞大量增殖，最终导致AA的发生。免疫抑制治疗（Immunosuppressive Therapy，IST）有效的AA患者Treg数量可明显增高，无效者Treg则无明显变化，这一临床结果也为此观点提供了强有力的佐证。 在接受以抗淋巴细胞免疫球蛋白（Antilymphocyte globulin ，ALG）或抗胸腺细胞免疫球蛋白（Antithymocyte globulin ，ATG）为基础的IST的AA患者中，也仅有约 2/3 患者造血功能得以不同程度的恢复，而超过 40%对此疗法无效的AA 患者，5 年后均死于出血或感染。因此，针对 AA，探索合适、有效、经济的治疗手段无疑是目前血液界致力解决的问题之一。 三氧化二砷（Arsenic Trioxide，ATO）具有促分化、诱导凋亡的功能，是目前急性早幼粒细胞白血病的一线治疗药物。作为一种普遍存在的环境毒物，包括ATO在内的砷剂能对机体免疫系统产生复杂的影响。越来越多的学者认为砷剂对免疫系统的损害可能是其诱发疾病的重要原因之一。尤其是对 T 细胞亚群及相关细胞因子分布的影响，近年来逐一被研究者所证实。研究发现，砷暴露可导致机体免疫功能损伤，其中 CD4+T 淋巴细胞可能为早期免疫损伤的靶点。我国学者郑树森院士团队通过小鼠心脏移植模型研究发现，ATO 能通过抑制细胞免疫来控制急性移植物抗宿主病（Graft-versus-Host Disease ，GVHD），在这个过程中CD4+T、CD8+T水平均降低，Th1相关细胞因子IFN-γ、TNF-α mRNA降低，Treg相关细胞因子TGF-βmRNA增高。也有研究者通过小鼠模型研究证实，低浓度砷剂能诱导细胞miR-2909表达从而抑制小鼠Th1细胞功能，导致小鼠免疫功能受损，感染发生率明显增加。 Treg 比例、数量及功能的异常在 AA的发生机制中具有重要的作用，而相关的毒理学及动物模型研究证实，ATO能通过增加Treg比例和/或数量来抑制机体的免疫功能，但目前尚无研究涉及ATO是否能够通过上调AA患者外周血Treg比例并抑制T细胞免疫功能以促进造血恢复。 目的 本研究采用流式细胞术检测不同浓度 ATO 对重型再生障碍性贫血（Severe Aplastic Anemia，SAA）患者外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）中CD4+CD25+CD127lowTreg比例的影响，并通过FoxP3 mRNA表达水平及细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1浓度检测对结果进行验证，以探讨ATO对SAA患者外周血中CD4+CD25+CD127low Treg比例的调节作用，并为不能接受造血干细胞移植（Hematopoietic Stem Cell Transplantation，HSCT）及IST效果不佳的AA患者探索更经济、有效的治疗方法。 材料和方法 1.一般资料 搜集河南省肿瘤医院、河南省人民医院就诊的初诊 SAA 患者 20 名，所有患者均按照要求签署知情同意书，其中女性13名，男性7名，中位年龄34（13-56）岁，所有患者均符合SAA诊断标准。 2.实验方法 通过流式细胞术检测不同浓度ATO（0、1、2.5、5μmol/L）处理的SAA患者PBMC中CD4+CD25+CD127lowTreg比例，通过RT-PCR检测FoxP3 mRNA表达水平并通过ELISA检测细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β1浓度对结果加以验证。 3.统计学分析 我们采用SPSS.22软件进行统计学分析，不同浓度组之间比较采用配对t检验。ATO 浓度与 Treg 比例、细胞因子浓度与 Treg 比例之间的相关性分析采用Spearman秩相关检验，FoxP3 mRNA表达水平与Treg比例之间的相关性分析采用Person相关检验。数据以均值±标准差（-X±S）出现，P<0.05认为差异具有统计学意义。 结果 1.ATO对SAA患者PBMC中Treg比例的影响 在浓度为2.5、5μmol/L时，ATO能明显上调Treg比例（P<0.001），且Treg比例与ATO浓度呈正相关，相关系数r=0.616（t=6.906，P<0.001），总体相关系数95%置信区间为（0.494，0.736）。 2.ATO对SAA患者PBMC中FoxP3 mRNA表达水平的影响 在1（P=0.032）、2.5（P<0.001）、5μmol/L（P<0.001）时，ATO均能明显上调Foxp3 mRNA表达水平，且Foxp3 mRNA表达水平与Treg比例呈正相关，相关系数r=0.523（t=5.419，P<0.001），总体相关系数95%置信区间为（0.380，0.666）。 3.ATO对SAA患者PBMC培养基上清中细胞因子浓度的影响 ATO在1、2.5、5μmol/L时能显著降低IFN-γ水平（P<0.001）；在2.5、5μmol/L时能显著降低 IL-4（2.5μmol/L 时，P=0.009；5μmol/L 时，P<0.001）、IL-17 （2.5μmol/L时，P=0.016；5μmol/L时，P<0.001）水平，在1（P=0.458）、2.5μmol/L （P=0.352）时对TGF-β1水平均无明显影响，在5μmol/L时能显著降低TGF-β1水平（P=0.032）。相关性分析显示，Treg比例与IFN-γ（r=-0.546，P<0.001）、IL-4 （r=-0.271，P=0.015）、IL-17（r=-0.293，P=0.008）浓度均呈显著负相关。 结论 ATO能够在一定浓度下上调SAA患者PBMC中CD4+CD25+CD127low Treg比例和Foxp3 mRNA表达水平，并不同程度的降低细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17水平。

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