经口给予右美托咪定对小鼠睡眠觉醒调节作用及机制研究

摘要

睡眠是生物界普遍存在的生理现象，其重要性不言而喻。随着社会竞争压力的增大，睡眠障碍性疾病不断增加。目前，治疗睡眠障碍性疾病的经典药物主要分为苯二氮革类和非苯二氮草类化合物，但其都不能模仿生理性睡眠尤其降低睡眠深度，长期应用不仅对神经系统造成损害亦可增加罹患阿尔兹海默病的风险。右美托咪定（dexmedetomidine）作为高选择性α2去甲肾上腺素受体激动剂，广泛应用于临床麻醉以及ICU镇静。有研究发现右美托咪定诱导的镇静催眠状态类似于睡眠剥夺后的睡眠反弹，且抑制呼吸轻微。但其对睡眠结构、睡眠能谱的影响以及其能否用于睡眠障碍性疾病的治疗依旧不清。此外，右美托咪定的临床给药途径主要为静脉泵注或儿科滴鼻，基础研究则以腹腔或脑内给药为主，经口给予右美托咪定的镇静催眠作用依旧不明。而经口给药不仅方便用药，提高患者依从性，亦可避免静脉给药带来的疼痛及感染相关风险。研究经口给予右美托咪定的镇静催眠作用及神经环路机制将有助于拓展右美托咪定的临床应用范围，为治疗睡眠障碍性疾病提供新思路。
　　目的:
　　本实验第一部分通过分析经口给予右美托咪定对小鼠夜间自主活动的影响初步评价其镇静作用。第二部分通过脑电/肌电(EEG/EMG)监测系统分别评价经口给予右美托咪定对小鼠夜间和白天的催眠作用以及对睡眠结构和脑波能谱的影响。第三部分，通过免疫组织化学实验，探索右美托咪定对小鼠大脑皮层及皮层下不同睡眠-觉醒调控脑区c-Fos蛋白表达的影响。
　　方法:
　　1小鼠自主活动测定
　　小鼠单独饲养于自主活动监测系统的透明记录笼中适应3天，而后进行实验。通过红外线自主活动监测系统的连续记录，监测给药后小鼠自主活动随时间的变化情况。系统从19:00开始记录，于21:00对照组经口给予生理盐水，实验组按分组分别经口给予25，50，100以及200μg/kg右美托咪定，连续记录24小时。由此分析不同剂量右美托咪定对小鼠夜间自主活动的影响，评价经口给予右美托咪定的镇静作用及剂量依赖性。
　　2睡眠觉醒行为记录与解析
　　雄性C57BL/6J小鼠埋植EEG/EMG记录电极恢复1周后，移至记录系统适应3天开始记录。第1部分实验，于19:00开始记录并连续记录48小时。实验第1天，各组小鼠皆于21:00经口给予生理盐水，该24小时所得数据作为自身对照;第2天同一时间按分组分别经口给予生理盐水和25，50，100以及200μg/kg右美托咪定，此24小时数据作为自身实验组。两次皆给予生理盐水组，则为组间阴性对照。由此，探索经口给予右美托咪定对小鼠夜间促眠作用的影响。第2部分实验，于07:00开始记录并连续记录48小时。实验第1天，小鼠皆于09:00经口给予或腹腔注射生理盐水，所得24小时数据为自身对照;第2天同一时间，小鼠经口给予(i.g.)或腹腔注射(i.p.)100μg/kg右美托咪定，所得数据为实验组。比较前后两天睡眠觉醒的改变，由此探索经口给予右美托咪定对小鼠日间睡眠结构以及睡眠能谱的影响，此外比较经口给药和腹腔注射这两种给药方式的区别。第3部分实验，于07:00开始记录并连续记录48小时。4组小鼠分别于09:00经口给予生理盐水，所得24小时数据为自身对照;第2天同一时间，按分组分别经口给予生理盐水，100μg/kg右美托咪定，6mg/kg地西泮，10mg/kg唑吡坦，所得24小时数据作为实验组。由此比较右美托咪定（100μg/kg）与阳性对照药地西泮（6mg/kg）、唑吡坦（10mg/kg）对小鼠日间睡眠觉醒的影响以及非快动眼睡眠（non-rapid eye movement sleep，NREM）期间delta能谱的影响。
　　3外界刺激唤醒实验
　　在EEG/EMG监测下，于21:00分别经口给予不同剂量右美托咪定(100、200μg/kg)，30min后待小鼠处于睡眠状态时，打开记录笼给予气流刺激观察小鼠EEG/EMG是否从睡眠状态转为觉醒状态并伴有体动反应。由此区分小鼠所处状态为镇静睡眠或麻醉状态。
　　4免疫组织化学实验
　　行为学实验结束后，将小鼠随机分为2组。在21:00分别经口给予生理盐水或100μg/kg右美托咪定，操作过程在＜101x的红光下进行，随后放回各自笼中。120min后灌注取脑。采用连续冰冻切片，进行免疫组织化学染色，观察大脑皮层及皮层下不同脑区c-Fos阳性神经元表达量的变化。
　　结果:
　　1经口给予右美托咪定显著降低小鼠夜间自主活动量
　　与对照组相比，经口给予右美托咪定50、100、200μg/kg可显著降低小鼠夜间自主活动，有效作用时间分别为2h、4h以及6h。然而，右美托咪定25μg/kg并未对小鼠自主活动产生显著性改变。分析给药后4h内自主活动总量变化，与对照组相比，右美托咪定50、100以及200μg/kg分别降低小鼠自主活动总量的67％、77％以及82％。
　　2右美托咪定增加小鼠夜间非快动眼睡眠量，减少觉醒时间
　　与自身对照相比，右美托咪定100μg/kg可持续增加4hNREM睡眠，每个小时分别增加至自身对照的2.7，3.5，1.7以及4.8倍。分析不同剂量给药后4h内小鼠NREM睡眠总量的改变，发现右美托咪定25，50，100以及200μg/kg可显著提高NREM睡眠至自身对照的1.9，2.3，2.7以及3.9倍。
　　3右美托咪定100、200μg/kg剂量诱导小鼠进入睡眠状态而非麻醉状态
　　外界刺激唤醒试验研究发现，右美托咪定100、200μg/kg给药后，外界气流刺激不仅能诱发小鼠EEG/EMG从NREM睡眠转为觉醒状态，同时小鼠伴有强烈的体动反应，表明本实验所用剂量与给药途径所诱导的状态非麻醉状态。
　　4右美托咪定通过减少短时程NREM睡眠数量，增加长时程NREM睡眠数量稳定小鼠白天睡眠结构。
　　与自身对照相比，右美托咪定100μg/kg白天给药可减少时间为4-16(P＜0.05),32-64（P＜0.05），64-128(P＜0.05),256-512(P＜0.05)s的NREM睡眠片段数量，增加时间为1024-2024(P＜0.01)和＞2024(P＜0.01)s的NREM睡眠片段数量。同时，持续时间为16-32(P＜0.01)，32-64(P＜0.01)，64-128(P＜0.01)，128-256(P＜0.01)s的REM睡眠片段显著降低。时间为4-16s的短时程觉醒片段次数显著降低(P＜0.01)。
　　5右美托咪定增加NREM睡眠期间delta能谱
　　与阳性对照药地西泮（6mg/kg）和唑吡坦（10mg/kg）相比，右美托咪定（100μg/kg）不仅显著增加NREM睡眠总量，延长睡眠时间，还可增加NREM睡眠期间的delta能谱，尤其增加波频为1.25-2.0Hz的delta慢波(P＜0.05)从而增加睡眠深度。而地西泮显著降低NREM睡眠期间波频为1.0-2.25Hz的delta慢波(P＜0.05)，唑吡坦给药后未对NREM睡眠的delta能谱产生显著性改变。
　　6右美托咪定降低大脑皮层及皮层下觉醒核团c-Fos阳性神经元数量，增加睡眠调控核团腹外侧视前区c-Fos阳性神经元数量。
　　与对照组相比，右美托咪定夜间给药可显著降低小鼠大脑皮层c-Fos阳性神经元数量，而腹外侧视前区(ventrolateral preoptic nucleus，VLPO)c-Fos阳性神经元数量显著增加。皮层下觉醒调控核团乳头结节核(tuberomammillary nuclei，TMN)、外侧下丘脑（lateral hypothalamus，LH）、臂旁核(parabrachial nucleus，PB)、背外侧被盖区(lateral parabrachial nucleus，LDT)以及蓝斑核(locus coeruleus，LC)的c-Fos阳性神经元数量显著降低。
　　结论:
　　经口给予右美托咪定不仅有着较强的镇静催眠作用，并且可以改善睡眠结构，增加睡眠深度，抑制皮层兴奋。其中，除蓝斑核参与调节外，腹外侧下丘脑、结节乳头核、外侧下丘脑、背外侧被盖区、臂旁核也参与其中。

目录

声明

摘要

中英文缩略词

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新点

参考文献

综述

个人简历

在学期间发表论文

致谢