腹外侧视前区腺苷及其受体对睡眠觉醒的调节作用及机制研究

摘要

睡眠受昼夜节律和内稳态因素的调控。腺苷是重要的内源性促眠物质，腺苷受体(Receptor, R)有四种亚型:A1R、A2AR、A2BR和A3R，大量研究显示:A1R和A2AR介导腺苷的促眠效应。研究表明:腺苷可通过A1R抑制基底前脑胆碱能神经元、结节乳头体核(TMN)组胺能神经元、和/或下丘脑外侧部orexin能神经元，促进睡眠。但全身或脑室内给予A1R激动剂对睡眠觉醒周期无明显影响;A1R基因剔除小鼠在基础状态和睡眠剥夺后，均无明显的睡眠异常。因此我们推测，腺苷作用呈现脑区依赖性，可能激活某些脑区的A1R，抑制睡眠。下丘脑腹外侧视前区(VLPO)是重要的睡眠中枢，我们推测激活VLPO区A1R可能抑制睡眠中枢，促进觉醒，抵消脑内给药抑制觉醒系统引起的睡眠。本研究利用高度自动化睡眠觉醒生物解析系统，结合药理学、免疫组织化学方法和A1R基因剔除小鼠，研究VLPO区A1R对自发性睡眠-觉醒及内稳态睡眠调节的作用及机制。
　　方法
　　1.利用高度自动化睡眠觉醒生物解析系统，在VLPO区埋置导管，手术恢复后，通过局部微注射方式给药，研究腺苷，A1R激动剂(CPA)、拮抗剂(CPT)及A2AR激动剂(CGS21680)、拮抗剂(MSX-3)对大鼠和小鼠基础状态下睡眠-觉醒行为的影响。
　　2.通过睡眠剥夺方式，结合脑电记录及微注射方法，研究VLPO区A1R是否参与睡眠内稳态调节。
　　3.通过Fos蛋白免疫组化染色方法，研究A1R在VLPO区对自发性睡眠-觉醒调节作用分子机制。
　　4.免疫组化染色方法，检测不同睡眠张力下，VLPO区A1R的表达。
　　研究结果
　　基础状态下，腺苷A1R和A2AR在VLPO区对睡眠-觉醒的作用及分子机制研究
　　1.大鼠双侧VLPO区内给予0.17、0.5或1.5 nmol/side腺苷A1R激动剂CPA剂量依赖性地减少非快动眼(Non-rapid eye movement，Non-REM，NREM)和快动眼(REM)睡眠，促进觉醒，大剂量作用维持时间达2小时，且CPA能即刻产生促觉醒效应，并使动物在给药后一个半小时内处于完全觉醒状态，提示VLPO区A1R参与了觉醒的诱导。
　　2.大鼠VLPO区内给予6、18.5或55 pmol/side腺苷A1R拮抗剂CPT能显著增加NREM睡眠，减少觉醒量，对REM睡眠有增加趋势，但无统计学差异。不同剂量CPT促眠作用维持时间均为5小时。VLPO区给予55 pmol/side CPT后，短时程NREM睡眠（持续时间＜64秒）出现次数增多，微小觉醒（持续时间＜16秒）增多，而长时程NREM睡眠和觉醒的出现次数并未发生变化，导致NREM睡眠及觉醒总的发生次数增加，觉醒平均持续时间缩短。NREM睡眠到觉醒，觉醒到NREM睡眠，以及REM睡眠到觉醒的转换次数也分别增加。此外，NREM睡眠Delta波活动在0.75-3.25 Hz频率段增强，睡眠深度增加。生理状态下阻断VLPO区A1R后，睡眠量及深度均增加，且增加的睡眠呈现明显的片段化，微小觉醒增多，提示动物维持觉醒困难，表明VLPO区内A1R参与了生理性睡眠觉醒的调节，并在觉醒维持中起重要作用。
　　3.野生型小鼠VLPO区内给予0.3 nmol/side CPA可以减少NREM和REM睡眠，增加觉醒量，作用维持时间为1小时;而在A1R基因剔除小鼠则未能引起睡眠觉醒的改变，说明CPA对A1R的激动具有高度特异性。
　　4.大鼠VLPO区内分别给予6、55或500 pmol/side A2AR激动剂CGS21680能剂量依赖地增加NREN和REM睡眠，减少觉醒量。大剂量(500 pmol/side)CGS21680促眠作用维持时间为5小时。VLPO区给予CGS21680(500pmol/side)后睡眠觉醒各参数变化情况如下:NREM和REM睡眠总发生次数增加，觉醒平均持续时间缩短。不同持续时间片段的NREM和REM睡眠（包括短时程和长时程）的发生次数均有不同程度的增加，而导致长时程觉醒片段的发生次数减少，短时程觉醒片段发生次数增加。除NREM睡眠到REM睡眠转换次数增加外，其他各时相之间的转换次数均未发生改变。NREM睡眠Delta频率段的波谱能量强度没有变化。这些结果表明激活VLPO区内A2AR诱导的睡眠与生理性睡眠相似，提示VLPO区可作为临床上治疗某些睡眠障碍疾病的潜在靶位。
　　5.大鼠VLPO区内分别给予5或10 nmol/side A2AR拮抗剂MSX-3对睡眠觉醒特征无明显影响，提示VLPO区A2AR在生理情况下不参与睡眠觉醒的调节。
　　6.大鼠VLPO区内分别给予0.5、1.5或4.5 nmol/side腺苷对睡眠觉醒特征无明显影响，可能是由于腺苷同时激活了A1R和A2AR，二者作用相互抵消所致。
　　7.Fos蛋白免疫组化研究显示:VLPO区给予CPA1.5nmol/side，脑内蓝斑(LC)、导水管周围灰质腹外侧部(VLPAG)、TMN活性增加，并在皮层有大量Fos蛋白表达。这些结果表明:生理情况下，VLPO区A1R的促觉醒作用，与觉醒核团LC、VLPAG和TMN有关。
　　8.荧光免疫染色表明:VLPO区有腺苷A1R表达，但表达水平较低;睡眠剥夺后，A1R表达水平增加，可能与防止动物睡眠剥夺后的过度睡眠有关。
　　睡眠剥夺后，VLPO区A1R对睡眠内稳态的调节
　　6小时睡眠剥夺后，VLPO区给予溶剂或A1R激动剂1.5 nmol/side CPA，发现与对照组相比， CPA能显著减少夺眠之后的睡眠反弹，即减少NREM和REM睡眠，增加觉醒量，作用维持时间为2小时;NREM和REM睡眠入睡潜伏期延长;NREM睡眠delta波谱能量强度减弱，睡眠深度减低。反之，6小时睡眠剥夺后给予A1R拮抗剂55pmol/side CPT，与对照组相比，在给予CPT后第2小时，睡眠剥夺后的睡眠反弹量增加(NREM睡眠增加，而REM睡眠无明显变化)，觉醒量减少，提示VLPO区A1R在睡眠内稳态调节中发挥重要作用。由于睡眠剥夺后，VLPO区A1R表达水平增高，结合睡眠剥夺行为学数据，我们认为，睡眠剥夺增加的A1R与防止过度睡眠有关。
　　小结
　　1.生理状态下，VLPO区A1R参与觉醒的诱导和维持。
　　2.激活VLPO区A1R后，觉醒增加。觉醒相关脑区LC、VLPAG和TMN可能参与这一作用。
　　3.VLPO区A1R参与了睡眠内稳态调节，防止睡眠剥夺后VLPO神经元的过度活化，即防止过度睡眠。
　　4.VLPO区A2AR在生理情况下不参与睡眠觉醒的调节。
　　5.VLPO区有腺苷A1R受体的低水平表达，睡眠剥夺后表达水平升高。

目录

缩略词表

图表序列

摘要

前言

材料与方法

1．材料

1．1．实验动物

1．2．药品

1．3．主要仪器

2．方法

2．1．大鼠和小鼠头、颈部EEG／EMG电极埋植及微注射导管留置手术

2．2．大鼠和小鼠EEG／EMG数据记录、解析

2．3．睡眠剥夺

2．4．导管及微注射针尖端定位

2．5．腺苷A1R荧光免疫组织化学染色

2．6．腺苷A1R和Fos蛋白免疫组织化学染色

2．7．VLPO区细胞计数

2．8．不同脑区Fos阳性细胞计数

2．9．实验方案

2．10．统计学处理

实验结果

1．导管及微注射针尖端定位

2．基础状态下，VLPO区A1R和A2AR对睡眠觉醒的调节

2．1．VLPO区给予腺苷对睡眠觉醒无明显影响

2．2．VLPO区A1R对睡眠觉醒的调节作用

2．3．VLPO区A2AR对睡眠觉醒的调节作用

2．4．基础状态下，VLPO区有腺苷A1R表达

2．5．VLPO区A1R激动后，觉醒相关脑区Fos蛋白表达增加

3．VLPO区A1R对睡眠内稳态的调节

3．1．睡眠剥夺后，VLPO区腺苷A1R表达增加

3．2．激活VLPO区A1R可减少睡眠剥夺后恢复期睡眠反弹

3．3．阻断VLPO区A1R可增加睡眠剥夺后睡眠反弹

实验结果图

讨论

小结

全文结论

本研究创新点

参考文献

综述 腺苷及其受体在不同脑区的睡眠觉醒调节作用

附录：博士期间已发表及待发表论文目录

致谢

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