MiR-433通过下调PAK4的表达抑制A549细胞增殖及迁移

摘要

目的: 近些年来肺癌发生率日益严重，并且以非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）最为严重，已经有研究报道miR-433(微小RNA 433)与胃癌，口腔鳞状细胞癌有关。尚未发现miR-433对人非小细胞肺癌A549(人肺腺癌A549细胞株)的影响。因此，本研究着重探讨 miR-433 对人非小细胞肺癌 A549 细胞增殖及迁移的作用，从而为非小细胞肺癌提供诊断的科学依据。 方法: 首先Real-time PCR（实时荧光定量PCR）法检测miR-433在A549、NCI-H1299（人非小细胞肺癌细胞株）、NCI-H358（人非小细胞肺癌细胞株）以及人肺成纤维细胞系HFL1中的表达。不同浓度miR-433 mimic（miR-433模拟物）转染A549细胞，选取最佳浓度进行后续分析；通过MTT法检测细胞增殖情况；采用Transwell小室检测细胞迁移情况；采用双荧光素酶报告基因法检测miR-433与PAK4（兔抗人P21活化激酶4）的靶向关系；利用Western blot法检测P21活化激酶4（PAK4）、LIMK1（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1）、p-LIMK1 （磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1）、Cofilin（肌动蛋白结合蛋白）和p-Cofilin （磷酸化肌动蛋白结合蛋白）的表达。 结果: 1. miR-433在三种NSCLC细胞中的表达显著下降，在A549组平均表达量为（0.42 ±0.047）其差异经过单因素方差分析有统计学意义（F=20.36，P<0.003）。 2.miR-433 mimic（80 nM）浓度组miR-433相对表达量142.02±10.25明显高于其他三组，经过单因素方差分析发现四组之间有统计学差异（F=26.32 ，P=0.004）提示过表达miR-433可显著抑制细胞增殖。 3. 为了了解过表达miR-433对A549细胞迁移的影响，随之进行Transwell试验，与空白对照组相比较，miR-433 mimic的一组图中显示A549细胞明显降低。miR-433 mimic可显著抑制A549细胞迁移（P=0.011）。 4.在WT组中mimic对照组与miR-433 mimic组的荧光素酶活性分别为1.00±0.120、0.42±0.024，这提示miR-433 mimic可显著抑制荧光素酶活性（P=0.015）为了观察 PAK4 基因和蛋白表达与 NSCLC 细胞系的三种细胞之间关系，PAK4 protein在A549、NCI-H1299、NCI-H358三者中分别为3.25±0.21、3.35±0.39、3.38±0.15。从条带中也可看出A549、NCI-H1299、NCI-H358明显增粗，这都提示了PAK4基因可能是NSCLC细胞的靶基因。 5.对于空白对照组、mimic control和miR-433 mimicPAK4、p-LIMK1、LIMK1、p-coflilin、coflilin 、GAPDH信号通路的影响分析以后发现，miR-433 mimic转染可显著抑制PAK4、p-LIMK1以及p-coflilin的表达，条带明显稀疏、变细。 结论: 1、miR-433在非小细胞肺癌细胞株中表达下调。 2、过表达miR-433可抑制A549细胞的增殖和迁移。 3、miR-433通过靶向下调PAK4的表达，抑制LIMK1/cofilin信号通路，抑制A549细胞的增殖及迁移。 4、miR-433作用机制的进一步研究对非小细胞肺癌的合理预防，科学诊断，判断预后提供新的研究方向。

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